论文摘要
目的:当今许多药物及手术方法的更新使周围动脉缺血性疾病的患者病情大为改善,但广泛的动脉狭窄和闭塞等严重下肢缺血性疾病仍然是困扰血管外科界的难题。随着分子生物学和分子遗传学的发展,利用转基因技术刺激缺血部位生长出健康有效的新生血管成为治疗性血管新生的研究热点,使重症缺血性疾病患者有了新的希望。但由于种种原因,使用转基因的治疗性血管新生至今较少有用于临床,其原因之一就是没有找到高效的基因载体细胞。成人的骨髓和外周血中内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPC）的发现为这种设想提供了可能。本课题的研究目的是在体外分离培养含EPC的兔骨髓单个核细胞稳定传代并诱导分化为血管内皮细胞,为进一步应用单个核细胞（bone marrow mononuclear cells,BM-MNC）作为基因载体细胞治疗严重缺血性疾病奠定基础。 方法:穿刺抽取兔骨髓,经密度梯度离心与免疫磁珠阴性筛选法获取富集EPC的BM-MNC,在含有生长因子的内皮细胞生长培养基（endothelial growth medium,EGM）中持续培养2月。期间使用倒置相差显微镜观察细胞贴壁与生长情况,流式细胞仪检测贴壁细胞表面表达血管内皮细胞特异性CD31抗原,荧光显微镜下贴壁细胞胞浆vWF,并检测贴壁细胞分泌NO和摄取acLDL功能,从形态、功能及其细胞表面特异性标志方面证实其内皮系细胞特性。 结果:培养第3d开始出现梭形贴壁细胞,约第7d出现团状聚集细胞集落;第7～10d的贴壁细胞表达vWF、CD31,摄取acLDL,分泌NO。贴壁细胞传代培养10代后接近融合,细胞扩增约210～310=1024～59049倍。 结论:在适宜血管内皮细胞生长环境下体外培养含EPC的BM-MNC获得成功并可稳定传代,可增殖诱导分化得到血管内皮系细胞。诱导分化的血管内皮系细胞,不仅有良好的外形也有良好的功能,体外培养经传代后呈级数方式增长,为BM-MNC诱导分化为内皮细胞用于大量移植提供了可能。
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