RAS系统抑制剂对肾动脉狭窄合并动脉粥样硬化大鼠动脉斑块形成与进展的研究

论文摘要

背景：肾动脉狭窄是由多种病因引起的一种肾血管疾病,其所引起的继发性病理生理改变主要为肾血管性高血压和随着狭窄程度的加重引起的缺血性肾病。如今,动脉粥样硬化性已成为肾动脉狭窄的首要病因。因此,研究不同类型抗高血压药物对肾动脉狭窄合并动脉粥样硬化的治疗效果迫在眉睫。RAS系统抑制剂有明确的降压作用,其中AT1阻滞剂厄贝沙坦已发现具有抗AS作用,而同属RAS系统抑制剂的直接肾素抑制剂阿利吉仑是否具有抗AS作用并与厄贝沙坦相比较是否具有优势值得进一步研究。目的：1、建立肾动脉狭窄合并动脉粥样硬化的大鼠动物模型；2、比较直接肾素抑制剂与AT1阻滞剂对肾动脉狭窄合并动脉粥样硬化的大鼠血压、血浆甘油三酯、总胆固醇、血肌酐,肾素活性（PRA）的影响;3、研究观察直接肾素抑制剂对肾动脉狭窄合并动脉粥样硬化大鼠的主动脉斑块部位巨噬细胞标记抗原CD68、血管平滑肌细胞标记抗原α-SMA及MMP-1,2,9的表达量及分布的影响,并与AT1阻滞剂对比研究,从而为临床合理、有效选用抗高血压药物治疗动脉粥样硬化提供理论依据。方法：1、动物模型的建立：将78只雄性SD大鼠随机分为一肾一夹（OneKidney One Clip,1K1C）组、二肾一夹（Two Kidney One Clip,2K1C）组及对照组,1K1C组及2K1C组采用平行针灸针缩窄法造成肾动脉狭窄,对照组则只暴露肾动脉,不做狭窄造模。行手术前后均测量血压及体重,凡造模手术后血压比手术前高20mmHg（大于正常血压值3个标准差）以上且高于115mmHg,视为手术成功者,对造模失败的大鼠进行淘汰[25]。二组大鼠与对照组均予各组大鼠均予注射VitD3 50万IU/kg并高脂饲养（10%猪油+5%白糖+2%胆固醇+0.5%胆酸钠）10周建立肾动脉狭窄合并动脉粥样硬化大鼠动物模型。2、饲养10周后,将对照组及满足实验要求的1K1C组和2K1C组分别随机分组并给予干预措施即：生理盐水组（0.9%NS2ml/d）、阿利吉仑组（50mg/kg.d）及厄贝沙坦组（100mg/kg.d）,干预时间为4周。3、上述措施干预4周后处理大鼠,分以下几部分进行试验：（1）禁食、禁饮8h后心脏采血,全自动生化分析仪检测血甘油三酯、胆固醇,血肌酐,放射免疫法检测血浆肾素活性（PRA）；（2）游离并切取SD大鼠主动脉及狭窄侧肾脏,将组织一部分石蜡包埋做HE染色（血管组织）和PAS染色（肾脏）；一部分一70°C冷冻保存；（3）免疫组织化学法检测实验大鼠主动脉弓处粥样斑块CD68,α-SMA, MMP-1,2,9的表达变化：取含粥样硬化斑块的各组主动脉石蜡切片,采用SABC法,PBS代替一抗作阴性对照,斑块区域出现棕黄色颗粒染色为阳性,分别检测巨噬细胞CD68、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及MMP-1,2,9蛋白在斑块上的表达变化,图像采集后用Image-pro plus 6.0软件分析,比较各组的平均光密度值；（4） Western—blot法检测MMP2在实验大鼠动脉斑块中的表达变化：取冷冻保存的各组主动脉组织100mg研磨成粉状,提取蛋白后100°C沸水中变性并检测蛋白浓度,上样后电泳,转膜,封闭,一抗4°C过夜,二抗室温孵育2h,滴加发光液后凝胶成像仪照相后用Quangtity one软件分析目的条带和内参条带灰度值,结果以比值表示,检测MMP2在各组大鼠动脉斑块中的表达变化。结果1、采用平行针灸针缩窄法联合高脂饮食（10%猪油+5%白糖+2%胆固醇+0.5%胆酸钠）并注射VitD350万IU/kg10周后,1K1C和2K1C大鼠血压,血浆总胆固醇与阴性对照组比较均有明显上升,P<0.05；其中2K1C组PRA与阴性对照组及1K1C组比较上升明显,P<0.05,HE染色可见主动脉弓处管腔内斑块样改变,证明该法可有效建立肾动脉狭窄合并动脉粥样硬化大鼠动物模型。2、RAS系统抑制剂对1K1C及2K1C模型血压及生化指标的影响。（1）血压：阿利吉仑和厄贝沙坦都可降低1K1C及2K1C组血压,2K1C组较为明显,两者在降压效果上比较无明显差异（P>0.05）。（2）血脂：阿利吉仑可明显降低1K1C及2K1C组血浆总胆固醇,分别与其生理盐水组比较,P<0.05。厄贝沙坦则无明显降低血浆总胆固醇作用,这种差异在2K1C组更为明显,两者比较,P<0.05。无论是阴性对照组还是1K1C及2K1C组,血浆甘油三酯比较未见统计学意义（数据未显示）（3）血浆肌酐：1K1C及2K1C组与阴性对照组比较,均有明显升高（P<0.05）,两组间比较无统计学意义,P>0.05。RAS系统抑制剂对1K1C组血浆肌酐的降低作用不明显,对2K1C组血浆肌酐的降低作用较为明显,分别与组内生理盐水组比较,均具统计学意义（P<0.05）,其中,阿利吉仑作用优于厄贝沙坦,两者比较,P<0.05。（4）肾素活性：1K1C及2K1C组PRA均有所升高,2K1C组与阴性对照组比较,P<0.05。论无对照组还是1K1C及2K1C组,厄贝沙坦组PRA均较生理盐水组及阿利吉仑组显著升高（P<0.05）。阿利吉仑组PRA则在各手术方式组均显著降低,分别与生理盐水组及厄贝沙坦组比较,均有统计学差异（P<0.05）。3、RAS系统抑制剂对1K1C及2K1C模型动脉粥样硬化形成与进展的影响。,α-SMA, CD68及MMP1,2,9于1K1C和2K1C生理盐水组分别与阴性对照组比较均升高,P<0.05。1K1C与2K1C生理盐水组之间除α-SMA比较无统计学意义之外（P>0.05）,CD68及MMP1,2,9 2K1C组均较1K1C组增加明显,P<0.05。关于RAS系统抑制剂干预后显示,在同个手术组内,CD68,α-SMA、MMP1,2,9在阿利吉仑组均较生理盐水组及厄贝沙坦组均显著降低（P<0.05）；厄贝沙坦组与生理盐水组比较,巨噬细胞CD68,α-SMA、MMP1,2,9也均较生理盐水组差异明显降低（P<0.05）。1K1C及2K1C组Western—blot测MMP2蛋白表达示,阿利吉仑组较厄贝沙坦组及生理盐水组均表达显著下降（P<0.05）,与免疫组化结果是一致的。结论：1、采用平行针灸针缩窄法联合高脂饲养并注射VitD3可有效建立肾动脉狭窄合并动脉粥样硬化动物模型。1K1C及2K1C组均可出现明显动脉粥样硬化改变。其中2K1C模型肾素活性明显升高,并且相对1K1C模型较易出现动脉粥样硬化改变。2、RAS系统抑制剂对于2K1C模型有较为明显的降压作用,阿利吉仑与厄贝沙坦降压作用比较无差异,两者都可显著降低2K1C组血浆肌酐浓度,阿利吉仑其作用优于厄贝沙坦。并且阿利吉仑未明显升高1K1C肌酐。3、AT1阻滞剂厄贝沙坦能够通过抑制斑块部位巨噬细胞CD68,α-SMA、MMP1,2,9发挥抗AS的作用。4、直接肾素抑制剂阿利吉仑较厄贝沙坦抑制斑块部位α-SMA、巨噬细胞CD68、MMP1、MMP2、MMP9力度更强,并明显降低大鼠血浆总胆固醇发挥抗AS的作用。

论文目录

• 1 RAS系统抑制剂对肾动脉狭窄合并动脉粥样硬化大鼠动脉斑块形成与进展的研究
• 1.1 中文摘要
• 1.2 英文摘要
• 1.3 前言
• 1.4 材料与方法
• 1.5 结果
• 1.6 讨论
• 1.7 结论
• 1.8 参考文献
• 1.9 英汉缩略词对照表
• 2 致谢
• 3 直接肾素抑制剂抗动脉粥样硬化作用的研究进展（综述）
• 参考文献