病毒诱导牙鲆上调表达基因的筛选及牙鲆色素上皮衍生因子的特征分析

论文摘要

牙鲆（Paralichthys olivaceus）是我国已经形成规模经济效益的几种重要海水养殖鱼类之一。随着养殖集约化程度的提高,近年来频繁遭受病毒性疾病的侵袭并导致巨大经济损失。因此,深入研究牙鲆免疫系统的分子机制将为牙鲆疾病特别是病毒病的预防提供理论依据。本研究选用紫外灭活的具有双链RNA基因组的草鱼出血病病毒（grass carp hemorrhage virus,GCHV）对牙鲆胚胎细胞（flounder embryonic cells, FEC）进行诱导,运用抑制性差减杂交技术（suppression subtractive hybridization, SSH）,成功构建了dsRNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞基因差异表达的差减cDNA文库。从差减cDNA文库中,通过PCR和斑点杂交两轮筛选,共得到有效ESTs为148个。所得序列通过生物信息学分析表明,这些EST代表的相应基因的功能包括细胞分裂、信号传导、细胞结构、细胞防御、蛋白表达和代谢等几个方面。在上调表达的EST中,有三个为色素上皮衍生因子（pigment epithelium- derived factor, PEDF）的同源基因（PoPEDF）,该基因属于丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor, serpin）超家族中无抑制活性的成员之一,编码蛋白具有抗血管增生、神经营养和保护功能。但关于该基因与病毒诱导研究还未见报道。通过RACE-PCR方法,从SMART cDNA文库得到了PoPEDF基因的全长cDNA共1803bp,开放阅读框长1212bp,编码403个氨基酸。序列同源性比较、蛋白结构分析、基因组DNA的外显子与内含子组合及系统进化分析等都表明PoPEDF为哺乳动物PEDF的同源基因。PoPEDF与GFP共转染细胞及免疫组化结果表明,牙鲆PEDF是一种分泌蛋白,合成后的PEDF主要分布于细胞质而不在细胞核。连续观察发现表达的PEDF逐渐向细胞外分泌。在哺乳动物中,PEDF是一个多功能蛋白,其功能和调节机制非常复杂。以牙鲆和牙鲆胚胎细胞为材料,用不同的诱导剂诱导,对牙鲆PEDF的功能特性作了初步探讨。结果显示,PEDF对ATRA的诱导变化不明显;低葡萄糖浓度可以诱导PEDF的上调表达,随着葡萄糖浓度的升高,PEDF的表达逐渐降低;缺氧时,PEDF先上调表达,随后再下调表达;随着细胞培养时间的增加,

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 第一节 天然免疫与获得性免疫的关系
• 1.1.1 天然免疫和获得性免疫的识别机制
• 1.1.2 模式识别受体
• 1.1.3 Toll及TLRs
• 1.1.4 天然免疫识别病原并启动获得性免疫
• 第二节 宿主细胞对病毒的防御机制
• 1.2.1 病毒的识别和抗病毒物质的产生
• 1.2.2 细胞凋亡
• 第三节 鱼类免疫系统
• 1.3.1 细胞因子
• 1.3.1.1 干扰素
• 1.3.1.2 肿瘤坏死因子α
• 1.3.1.3 IL-1β
• 1.3.2 趋化因子
• 1.3.3 补体系统
• 1.3.4 TLRs
• 1.3.5 抗菌肽
• 第四节 本研究的目的和意义
• 第二章 紫外灭活GCHV诱导的牙鲆胚胎细胞差减cDNA文库的构建
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 细胞株与病毒株
• 2.1.2 细胞培养
• 2.1.3 病毒增殖、纯化与紫外线灭活
• 2.1.3.1 病毒增殖
• 2.1.3.2 病毒纯化
• 2.1.3.3 病毒灭活
• 2.1.4 牙鲆胚胎细胞（FEC）的诱导
• 2.1.5 诱导后牙鲆胚胎细胞抗病毒物质检测
• 2.1.6 差减cDNA文库的构建
• 2.1.6.1 病毒诱导牙鲆胚胎细胞的制备
• 2.1.6.2 病毒诱导和对照FEC总RNA的提取
• 2.1.6.3 病毒诱导和未经诱导的FEC mRNA的分离
• 2.1.6.4 差减cDNA文库的建立
• 2.1.6.5 Tester cDNA接头连接效率检测和差减文库差减效率检测
• 2.1.7 差减cDNA质粒文库的构建
• 2.1.7.1 E coli. DH5α感受态的制备
• 2.1.7.2 连接
• 2.1.7.3 转化
• 2.1.8 差减文库cDNA 片段大小检测
• 2.2 结果
• 2.2.1 紫外灭活GCHV诱导的FEC抗病毒活性检测
• 2.2.2 Tester cDNA的接头连接效率的检测
• 2.2.3 cDNA文库差减效率检测
• 2.2.4 差减文库cDNA片段大小的鉴定
• 2.3 讨论
• 第三章 差减cDNA文库的筛选及ESTs分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试剂、酶及载体
• 3.1.2 PCR筛选
• 3.1.3 斑点杂交筛选
• 3.1.3.1 差减cDNA文库探针和对照cDNA文库探针的制备
• 3.1.3.2 斑点杂交
• 3.1.3.3 阳性克隆筛选
• 3.1.4 阳性克隆cDNA片段测序及序列分析
• 3.1.5 SMART cDNA的合成
• 3.1.6 PCR检测
• 3.2 结果
• 3.2.1 差减cDNA片段的PCR筛选
• 3.2.2 差减cDNA片段的斑点杂交筛选
• 3.2.3 差减cDNA片段的序列测定和分析
• 3.2.4 部分差减cDNA片段的差异表达分析
• 3.3 讨论
• 第四章 色素上皮衍生因子基因的克隆、分析和鉴定
• 4.1 前言
• 4.1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂
• 4.1.2 色素上皮衍生因子
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试剂、酶及载体
• 4.2.2 RACE-PCR克隆PEDF基因全长cDNA
• 4.2.3 PCR产物回收
• 4.2.4 感受态细胞的制备、连接、转化及阳性克隆筛选
• 4.2.5 细胞及组织总RNA的提取
• 4.2.5.1 细胞及组织总RNA的TRIzol一步法提取
• 4.2.5.2 组织总RNA的SV Total法提取
• 4.2.6 RT-PCR
• 4.2.7 Real-time PCR
• 4.2.8 牙鲆基因组DNA的提取
• 4.2.9 PEDF基因组DNA的克隆
• 4.2.10 PEDF基因的生物信息学分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 紫外灭活GCHV诱导PEDF的上调表达
• 4.3.2 PEDF全长cDNA的克隆
• 4.3.3 PEDF cDNA序列分析
• 4.3.4 PEDF的氨基酸序列的比较分析
• 4.3.5 牙鲆PEDF基因组DNA结构
• 4.3.6 PEDF基因的染色体定位及PEDF基因的进化分析
• 4.4 讨论
• 第五章 PEDF蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 原核表达载体的构建
• 5.1.2.1 引物设计
• 5.1.2.2 表达片段的克隆
• 5.1.2.3 酶切
• 5.1.2.4 目的片段的回收
• 5.1.2.5 连接、转化及筛选
• 5.1.3 诱导表达筛选阳性克隆
• 5.1.4 PEDF的大量表达
• 5.1.5 pET32a-PEDF的包涵体制备
• 5.1.6 pET32a-PEDF的树脂纯化
• 5.1.7 pET156-PEDF蛋白的纯化
• 5.1.7.1 包涵体的制备
• 5.1.7.2 溶解包涵体和重折叠
• 5.1.7.3 透析
• 5.1.8 多克隆抗体的制备
• 5.1.9 细胞和组织蛋白的提取
• 5.1.9.1 TRIzol法细胞和组织蛋白的提取
• 5.1.9.2 一步法细胞和组织蛋白的提取
• 5.1.10 Western免疫印迹
• 5.1.11 免疫吸附
• 5.2 结果
• 5.2.1 克隆片段的PCR扩增及克隆
• 5.2.2 表达载体的构建
• 5.2.3 原核表达与鉴定
• 5.2.4 多克隆抗体的制备与鉴定
• 5.3 讨论
• 第六章 牙鲆PEDF蛋白的亚细胞定位
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 牙鲆胚胎细胞总RNA的提取
• 6.1.3 逆转录
• 6.1.4 牙鲆PEDF 编码区cDNA的扩增
• 6.1.5 牙鲆PEDF 编码区cDNA的克隆
• 6.1.6 PEDF与EGFP融合蛋白表达载体的构建
• 6.1.7 pEGFP-PEDF质粒转染牙鲆胚胎细胞
• 6.1.8 细胞免疫组化
• 6.2 结果
• 6.2.1 牙鲆编码区cDNA的扩增
• 6.2.2 pEGFP-PEDF融合基因真核表达载体的构建
• 6.2.3 细胞转染和免疫组化结果
• 6.3 讨论
• 第七章 PEDF的诱导表达特征分析
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 ARTA诱导
• 7.1.3 低氧诱导
• 7.1.4 CoC12诱导
• 7.1.5 葡萄糖诱导
• 7.1.6 细胞老化过程中PEDF的表达
• 7.1.7 病毒及poly（I:C）诱导
• 7.1.8 PEDF细胞保护实验
• 7.1.9 牙鲆体内攻毒实验
• 7.1.10 细胞及组织总RNA的提取
• 7.1.11 Real-time PCR
• 7.2 结果
• 7.2.1 ARTA诱导表达结果
• 7.2.2 低氧状态下PEDF的表达时序
• 7.2.3 PEDF表达量与细胞培养时间无关
• 7.2.4 葡萄糖诱导诱导表达结果
• 7.2.5 PEDF在病毒诱导的FEC细胞中上调表达
• 7.2.6 PEDF的保护实验
• 7.2.7 攻毒前后牙鲆组织PEDF的表达
• 7.3 讨论
• 参考文献
• 总结
• 附录
• 致谢