水稻全长cDNA文库的构建和两个microRNA的功能研究

论文摘要

水稻是全球最重要的粮食作物之一。水稻遗传改良的关键是寻找能调节水稻株高、分蘖数、抽穗期、穗的大小和育性等重要农艺性状的基因。以MicmRNA为代表的内源small RNA分子是生物生长发育关键调节因子,为水稻的遗传改良提供了新的基因资源。本研究包含三方面的内容:一是构建水稻全长cDNA文库,得到13000个以上的全长cDNA克隆,同时构建用于酵母双杂交筛选的cDNA文库;二是系统的分析水稻中的OsSPL（Oryza Sativa SQUAMOSA Promoter-binding Like）基因,特别是miR156的靶基因;三是以筛选控制水稻重要农艺性状的small RNA基因为目标,重点研究miR156和miR164在水稻生长发育中的调节机制。cDNA文库的构建的结果如下:1.利用改良的Oligo-capping方法构建了全长比例在92%以上的水稻幼穗的cDNA文库,并对3000个随机挑选的克隆测序。此外,从本实验室已有的cDNA文库中筛选了10828个包含完整读码框的cDNA克隆。总共得到了13650个全长cDNA克隆。2.构建了两个用于酵母双杂交的cDNA文库,在本实验室已成功用于转录因子、mRNA剪切因子、未知基因等不同类型基因的互作蛋白的筛选,假阳性率在10%以下。miR156及靶基因OsSPL基因分离鉴定的主要结果如下:1.分析了水稻中miR156的靶基因OsSPL家族。主要包括水稻中18个OsSPL基因的分离、植物中SPL基因的进化分析、保守结构域的分析,并分析了OsSPL基因在水稻的13不同发育时期的组织中的表达水平。对8个OsSPL基因进行了超表达。2.序列分析表明水稻中11个OsSPL基因含miR156的结合位点（M156BR,miR156 binding region）。通过Northern blot的结果表明,OsSPL12和OsSPL14的mRNA分子被miR156-RISC切断。3.RLM-RACE分析OsSPL14和OsSPL17被miR156-RISC切断的位置。miR156-RISC在M156BR的第7和8个核酸之间的位置切断靶基因,正好位于M156BR与miR156错配的核酸的位置。4.对miR156的一个靶基因OsSPL14进行了定点诱变,得到不受miR156调节的基因OsSPL14ml和OsSPL14m2,并对OsSPL14m2进行了超表达。5.通过Y2H筛选穗的cDNA文库,得到了OsSPL14的6个互作蛋白。其中三个是与ubiquitin途径相关的RING finger类蛋白,表明OsSPL14除了受miR156调节外,蛋白的稳定性可能还受ubiquitin途径的调节。miR156和miR164功能研究主要结果如下:1.在玉米Ubiquitin启动子的作用下超表达了miR156和miR164,得到了miR156的两个前体（pri-miR156b和pri-miR156h）的超表达植株（Md和Mh）和miR164一个前体（pri-miR164b）的超表达植株（MI7）。2.分析了Md和Mh的T4代植株与WT（wild type）在生长和发育上的差异。在苗期（四叶期以前）Md和Mh与WT无差异。在第四叶生长出以后,Md和Mh的叶片和分蘖发生的速度是WT的3倍以上。到灌浆期,Md和Mh植株叶片的数目是WT的100倍以上,有效分蘖的数目是WT的50倍以上。在大田种植条件下（武汉7月至10月）Md和Mh的营养生长延长,抽穗期推迟7天以上。Md和Mh植株高度只有WT的50%,穗的二次枝梗和颖花数变少。通过比较Md和Mh的叶片大小、叶片表皮细胞的发育情况和SAM（shoot apical meristem）的大小,推断miR156超表达改变了水稻的发育时间。3.通过small RNA gel blot分析miR156在不同“年龄”的叶片中的表达水平表明miR156的高低与叶片发育时间正相关,miR156是叶片发育时间的Marker基因。4.利用水稻的全基因组芯片分析了Md/Mh和WT植株的老叶和新叶中基因的表达情况,并据此分析miR156的下游基因以及叶片发育时间相关的基因。5.比较了含M156BR的OsSPL基因在Md/Mh和WT不同器官中的表达量,结果表明miR156-OsSPL基因的互作受其他因子的调节,可能的调节因子有DRG12和已报道的PLA2。6.在叶片的生长发育过程中miR164表达模式与miR156正好相反,说明两者在叶片的发育过程中存在联系。同时在small RNA gel blot中还检测到一个表达模式与成熟miR164相反的未知前体,表明miR164的水平受启动子和microRNA形成过程的双重调节。7.序列分析表明水稻中仅有OsNAC1和OsNAC2含M164BR（miR164 bindregion）。RLM-RACE分析也证明OsNAC1和OsNAC2的mRNA在M164BR第10个核酸的位置被切断。OsNAC1和OsNAC2的转录本在不同发育时间的叶片中,表达模式与miR164的表达模式相反。8.miR164能调节水稻叶片的边界。在miR164超表达的MI7植株中,叶鞘边缘融合、部分叶片融合或扭曲,在一些极端的植株中有类似拟南芥cup-shaped的结构形成。MI7叶片发育的缺陷随植株生长时间的增加而加剧。9.miR164调节水稻的生殖生长。MI7的花药形态发育异常,花粉完全不育。MI7虽能正常开花,但胚和胚乳不能正常发育。正常抽穗开花的MI7主分蘖的倒数第二个节（穗颈节的前一个节）未伸长。MI7的叶片中,一个Flowers Locus T（FT）的同源基因（MI7D1）被抑制。在长日照条件下,OsNAC1、OsNAC2和MI7D1的表达与日照有关,OsNAC1和OsNAC2表达的最高峰在黑暗时间段的正中点。10.miR164的超表达改变了水稻体内的激素水平。通过外施生长素和细胞分裂素可以使MI7生长发育恢复正常。在MI7植株中部分生长素合成、运输和应答的基因被抑制。11.通过比较不同植物中miR156和miR164的表达,发现miR156-miR164在禾本科作物中保守,但在油菜叶片中存在不同的表达模式。12.根据以上结果,可以推断出以下结论:miR156是控制水稻发育特别是叶片发育的异时性基因。miR164在水稻中除了调节器官边界外,还具有与拟南芥中不同的功能—调节水稻的生殖生长。最后,一个miR164-miR156Paradigm的模型用来解释miR156和miR164在协同调节水稻器官发生、生长和成熟过程中的作用。MicroRNA表达模式的改变和靶基因数目的变化是miR156-miR164进化的重要组成部分。

论文目录

• 缩略名词表
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 MICRORNA—具有调节功能的NO-CODING RNA
• 1.1.1 Modern small RNA world
• 1.1.2 MicroRNA基因的发现和特点
• 1.1.3 MicroRNA在拟南芥中的形成过程
• 1.1.4 MicroRNA的对靶位点的识别
• 1.1.5 microRNA调节靶基因的机制
• 1.1.6 MicroRNA的进化
• 1.1.7 与MicroRNA相关的一些研究方法
• 1.2 MICRORNA在拟南芥生长发育中的调节作用
• 1.2.1 MicroRNA与植物的生长发育
• 1.2.2 MicroRNA与植物的激素
• 1.2.3 MicroRNA与植物的逆境应答
• 1.2.4 MicroRNA与small RNA的代谢
• 1.3 其他几类具有调节功能的SMALL RNA的研究进展
• 1.3.1 26—30nt长的small RNA
• 1.3.2 Natural siRNA
• 1.4 水稻功能基因组学与全长cDNA文库
• 1.4.1 水稻基因功能研究的平台技术
• 1.4.2 全长cDNA文库的意义和技术
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 水稻材料
• 2.1.2 菌株
• 2.2 RNA抽提
• 2.3 cDNA文库构建
• 2.4 水稻基因的克隆与转化
• 2.4.1 OsSPL基因转化载体的构建
• 2.4.2 基因的定点诱变
• 2.5 基因表达分析
• 2.5.1 Northern Blot
• 2.5.2 Semi-quantitative RT-PCR
• 2.5.3 Real-time qRT-PCR
• 2.5.4 Small RNA表达量检测
• 2.5.5 Microarray分析水稻转录组
• 2.5.6 RLM-RACE分析miRNA-RISC切断靶RNA的位点
• 2.6 酵母双杂交
• 2.6.1 Bait的构建
• 2.6.2 文库的筛选
• 2.6.3 互作的验证
• 2.7 序列分析
• 2.8 组织细胞学
• 2.8.1 石蜡切片
• 2.8.2 表皮细胞观察
• 2.8.3 SEM
• 2.8.4 水稻器官的整体装片观察（whole mount）
• 2.8.5 In situ hybridization
• 2.9 植物生长与表型统计
• 2.10 水稻的激素处理
• 2.10.1 用于基因表达材料的激素处理
• 2.10.2 MI7的激素处理
• 3 结果与分析
• 3.1 水稻全长cDNA的分离
• 3.1.1 明恢63 Normalized cDNA文库中全长cDNA的分离
• 3.1.2 cDNA文库的构建
• 3.2 MIR156与OsSPL基因的功能分析
• 3.2.1 水稻miR156和SPL基因的分离与分析
• 3.2.2 miR156与植物生长发育的调节
• 3.2.3 miR156-OsSPL的互作与发育时间有关
• 3.2.4 miR156的调节机制
• 3.2.5 miR156与OsSPL基因互作的时间特异性
• 3.2.6 Affymetrix rice microarray分析Md/Mh中转录组
• 3.2.7 miR156-OsSPL互作的调节因素
• 3.2.8 miR156的原位杂交
• 3.2.9 Pri-miR156d和Pri-miR156h的表达与miR156表达模式相似
• 3.2.10 OsSPL14基因的功能研究
• 3.3 MIR164与水稻的发育
• 3.3.1 水稻中miR164的序列分析与靶基因预测
• 3.3.2 水稻中miR164的超表达
• 3.3.3 miR164超表达对水稻生长发育的影响
• 3.3.4 miR164的表达
• 3.3.5 MI7的芯片分析
• 3.3.6 miR164与光周期
• 3.3.7 miR156-miR164的关系
• 4 讨论
• TM技术的CDNA文库的应用'>4.1 基于GATEWAY^TM技术的CDNA文库的应用
• TM技术的文库的优点'>4.1.1 基于Gateway^TM技术的文库的优点
• 4.1.2 cDNA文库构建的下一步设想
• 4.2 MIR156在水稻生长发育中的作用
• 4.2.1 miR156调节植物发育的时间
• 4.2.2 miR156是水稻叶片发育时间的Marker基因
• 4.2.3 miR156的启动子控制miR156的表达
• 4.2.4 miR156-OsSPL互作调节因子
• 4.2.5 Md和Mh表型的部分解释
• 4.3 MIR164在水稻生长发育中的调节作用
• 4.3.1 miR164调节叶原基的发育
• 4.3.2 miR164的功能与激素有关
• 4.3.3 miR164在水稻中的新功能
• 4.4 MIR156—MIR164PARADIGM模型
• 4.4.1 miR156-miR164的调节模型
• 4.4.2 水稻叶片的发育受众多基因的协同调节
• 4.4.3 miR156-miR164与植物进化
• 4.5 下一步工作设想
• 4.5.1 利用miR156来控制水稻的发育和形态
• 4.5.2 miR164
• 4.5.3 Stem-loop qRT-PCR高通量筛选stress responsive small RNA
• 参考文献
• 附录A 引物列表
• 附录B PROTOCOLS
• PROTOCOL 1 CDNA LIBRARY AND SEQUENCING
• Highthroughputplasmidpreparationforsequencing
• Modified Template-switch Method Full-length cDNA Library Construction
• Modified Oligo-capping cDNA Library Construction
• PROTOCOL 2 SMALL RNA ANALYSIS
• Small RNA Gel Blot
• Cleavage Site Mapping of MicroRNA-Targeted mRNAs
• 简历
• 致谢