蟹类过敏原的研究

论文摘要

食物过敏是人类常见的一种过敏性疾病,主要由食物中的蛋白质引起。主要症状有哮喘、荨麻疹等,严重的甚至会危及到生命。虽然国外已有大量研究证实原肌球蛋白是甲壳类动物的主要过敏原,但是由于物种的不同,以及人种等各方面的差异,对我国消费者而言,蟹类主要过敏原是否为原肌球蛋白,或者是其他蛋白,仍有待进一步研究证实。中华绒鳌蟹（Eriocheir sisensis）、锯缘青蟹（Scylla serrata）和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）等蟹类肉味鲜美,营养丰富,是我国蟹类增养殖的重要对象,远销日本及东南亚国家,也是全球的主要经济蟹类。随着消费人群的扩大,过敏人数越来越多。但以中华绒鳌蟹、锯缘青蟹和三疣梭子蟹等为对象的过敏原研究尚未见报道。据此,本研究以国内特有的中华绒螯蟹以及产量丰富的锯缘青蟹、三疣梭子蟹等为研究对象,从免疫检测、分离纯化、抗体制备、分子克隆、原核表达等方面对蟹类的过敏原进行了研究。首次证实了中华绒螯蟹的主要过敏原为原肌球蛋白,并对其进行重组表达,为今后蟹类过敏原的标准化生产提供了技术参考。采用免疫印迹法,利用过敏患者血清,确定中华绒螯蟹的主要过敏原为分子量约38 kDa的蛋白,其它8个次要过敏蛋白组分（27、45、105 kDa等）也参与了过敏反应。通过制备丙酮粉、等电点沉淀、硫酸铵沉淀及加热处理对分子量为38 kDa的主要过敏蛋白进行了高度纯化。该蛋白的pI约为4.5,与虾的原肌球蛋白Pen a 1性质相近。进一步实验证实了该蛋白为原肌球蛋白。通过免疫新西兰大白兔,制备了原肌球蛋白的抗血清,采用Protein A Sepharose亲和层析柱对抗体进行了纯化。该抗血清效价高,稀释度达409600倍。该抗体与甲壳类动物及软体动物的原肌球蛋白具有较强的免疫交叉反应,可以应用于后续的食品过敏原的检测。通过分子生物学技术方法,分别克隆得到中华绒鳌蟹、锯缘青蟹和三疣梭子蟹的原肌球蛋白基因序列。测序结果表明,三个基因的序列长度均为855 bp,编码284个氨基酸残基,三者间氨基酸序列同源性为99.3 % ,三段序列均已登录Genbank。三种蟹的原肌球蛋白基因序列与GenBank中其他甲壳类动物的原肌球蛋白有很高的同源性。与褐对虾原肌球蛋白的8个IgE结合位点相比,只在第一个位点中有6个氨基酸残基不一致,其他7个位点均相同。将中华绒鳌蟹的原肌球蛋白基因与pGEX-4T-3载体连接后,转化大肠杆菌JM109,经IPTG诱导得到分子量约为62 kDa的融合表达蛋白。通过与甲壳类过敏患者血清的免疫印迹反应,证实融合表达的原肌球蛋白具有过敏原性,表明原肌球蛋白是蟹类的主要过敏原之一。该融合蛋白有望用于甲壳类食物过敏诊断试剂的开发与应用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 食物过敏
• 1.2 食物过敏反应的种类及机理
• 1.3 国内外研究现状
• 1.3.1 流行病学调查
• 1.3.2 水产品中存在的过敏原
• 1.3.2.1 小清蛋白（Parvalbumin）
• 1.3.2.2 原肌球蛋白（Tropomyosin）
• 1.3.2.3 精氨酸激酶（Arginine kinase）
• 1.3.3 过敏原诊断及检测方法
• 1.3.4 过敏原脱敏方法
• 1.3.5 目前面临的问题
• 1.3.6 过敏原基因的克隆
• 1.3.6.1 氨基酸测序与分子克隆相结合
• 1.3.6.2 同源序列法
• 1.3.6.3 生物信息学方法
• 1.4 本文的研究目的和意义
• 1.5 主要研究内容及目标
• 1.6 技术路线
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 动物
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 实验所用溶液及其配制
• 2.1.3.1 SDS-PAGE 所用溶液
• 2.1.3.2 Western blot 蛋白质印迹试验所用溶液
• 2.1.3.3 质粒提取用溶液
• 2.1.3.4 大肠杆菌感受态细胞制备及转化用溶液
• 2.1.3.5 琼脂糖电泳所用溶液
• 2.1.3.6 GST 融合蛋白纯化所用溶液
• 2.1.4 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 粗提物制备
• 2.2.2 SDS-PAGE
• 2.2.2.1 SDS-PAGE 胶的制备
• 2.2.2.2 样品SDS-PAGE
• 2.2.3 Western blot 分析
• 2.2.4 肌原纤维的制备
• 2.2.5 主要过敏原的纯化
• 2.2.5.1 丙酮粉的制备（肌原纤维部分）
• 2.2.5.2 蟹类过敏蛋白的抽提
• 2.2.5.3 等电点沉淀
• 2.2.5.4 硫酸铵沉淀
• 2.2.5.5 加热
• 2.2.6 抗体制备及纯化
• 2.2.6.1 抗血清制备
• 2.2.6.2 血清滴度的确定
• 2.2.6.3 多克隆抗体的纯化
• 2.2.7 不同水产品粗提物的制备及检测
• 2.2.8 基因克隆及序列分析
• 2.2.8.1 引物设计
• 2.2.8.2 蟹类组织总RNA 的提取
• 2.2.8.3 反转录合成cDNA 第一链
• 2.2.8.4 PCR 扩增基因片段
• 2.2.8.5 PCR 扩增产物的电泳检测及目的基因片段的回收
• 2.2.8.6 基因片段与pBS-T 载体的连接
• 2 法制备感受态细胞'>2.2.8.7 CaCl₂法制备感受态细胞
• 2.2.8.8 连接产物的转化及重组质粒的鉴定
• 2.2.8.9 核苷酸序列的测定及分析
• 2.2.9 TM 的原核表达及纯化
• 2.2.9.1 表达载体pGEX-4T-3 质粒的提取
• 2.2.9.2 表达载体及TM DNA 的酶切消化
• 2.2.9.3 表达载体与TM DNA 的连接，转化及重组表达质粒的鉴定
• 2.2.9.4 GST-TM 的诱导表达
• 2.2.9.5 表达产物的电泳检测及分析
• 2.2.9.6 重组蛋白GST-TM 的亲和纯化
• 第三章 结果与分析
• 3.1 中华绒螯蟹过敏组分的分析与鉴定
• 3.1.1 粗提物组分的分析
• 3.1.2 中华绒鳌蟹粗提液过敏蛋白的检测
• 3.1.3 中华绒螯蟹肌肉加热前后的差异
• 3.2 中华绒螯蟹主要过敏原的纯化
• 3.2.1 丙酮粉制备及盐溶结果
• 3.2.2 等电点沉淀
• 3.2.3 硫酸铵沉淀
• 3.2.4 加热处理
• 3.3 中华绒螯蟹主要过敏原的抗体制备
• 3.4 不同水产品粗提物的制备及检测
• 3.5 基因克隆、序列测定与分析
• 3.5.1 目的基因的克隆与鉴定
• 3.5.2 重组质粒的PCR 验证
• 3.5.3 TM 序列的测定与分析
• 3.6 TM 的原核表达与纯化
• 3.6.1 表达质粒的构建与鉴定
• 3.6.2 GST-TM 的诱导表达
• 第四章 讨论
• 4.1 主要过敏原检测、纯化及抗体制备
• 4.2 原肌球蛋白的克隆与表达
• 4.3 结论
• 4.4 研究展望
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的学术论文