辣椒疫病生防菌Penicillium striatisporum Pst10的筛选、抗菌物质分离纯化及分子标记

论文摘要

辣椒疫病是由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）引起的、世界范围内普遍发生的、毁灭性土传病害,20世纪90年代曾在中国20多个省连续爆发,造成了巨大的经济损失。由于疫霉菌特殊的生物学性状及其所在的土壤生态环境的复杂性,该病害的化学防治一直较为困难。尽管有许多用生防微生物控制该病害发生的报道,但防效均不理想。本研究从挖掘生防微生物资源、获得天然抗菌化合物角度出发,开展了从各种生境中进行辣椒疫霉拮抗菌的筛选、盆栽防效试验、拮抗物质生成的最适培养条件确定、拮抗物质的分离纯化、鉴定及分子标记研究,取得如下结果。以辣椒疫霉为靶标病原菌,从连作辣椒不同年限的土壤、用不同原料及制作工艺制得的堆肥、各种蔬菜作物体内等各种生态环境中筛选到辣椒疫霉的拮抗菌205株,其中拮抗真菌32株,拮抗放线菌78株,拮抗细菌95株,其中内生芽孢细菌37株。将在室内平板上拮抗作用强、持续时间长的放线菌A576、A329、芽孢细菌B105、BS211、真菌Tpc、Pst10进行液体培养,通过各菌株无菌培养滤液（sterile liquid culture filter,SLCF）对辣椒疫霉的抑菌活性及各菌株菌体及液体培养物对辣椒疫病的盆栽防效比较,显示真菌Pst10有较好的辣椒疫病生防潜力。经中国农业科学院微生物菌种保藏中心鉴定,Pst10为青霉稀有种Penicillium striatisporum。首次报道在中国境内分离到该种青霉,并将其应用于植物病害的生物防治。抗菌谱测定表明青霉Pst10对P. capsici、P. infestans、P. drechsleri、P. nicotianae、 P. megasperma五种疫霉菌的菌丝生长均有强烈的抑制作用,拮抗带宽度30mm,并且对Cladosporium cucumerium和Sclerotinia sclerotiorum也有较强的拮抗作用,且在室内平板上,拮抗带30天不消失。Pst10液体培养制备的SLCF能杀死辣椒疫霉菌丝细胞,抑制孢子囊的形成,抑制孢子囊及孢子的萌发,SLCF稀释10-100倍仍能使辣椒疫霉菌丝呈现直径明显增粗、菌丝前端扭曲、菌丝分枝增加、分枝菌丝节间缩短等畸形症状。在辣椒基质盆栽实验中,单独施用Pst10的SLCF,在6天内能完全抑制疫病的发生,13天后,防效仍保持45%。在菜园土盆栽实验中,有机肥能明显促进Pst10在辣椒根际的定殖：盆钵栽苗10d后,青霉Pst10+有机肥处理中,辣椒根际青霉Pst10的数量是单独施加青霉Pst10处理的3倍；20d后上升为17倍。接种后40d,青霉Pst10在根际的数量仍有2.55×104cfu/g干土,占根际真菌总数的53%,有很强的定殖及保持优势种群的能力。青霉Pst10不同处理的防病实验结果显示：SLCF+Pst10+有机肥的处理对辣椒疫病的防效最好,移栽后14天,疫病发病率也仅有10%,对照发病率为100%。Pst10在5种固体培养基上的菌丝生长速度、分泌物及孢子产生数量等生物学形状有很大差别,OAT是最适宜的产孢培养基。Pst10在9种液体培养基中的生物量、菌丝球形状及SLCF的抗菌活性也有显著性差异。综合考虑菌丝生物量和SLCF的抗菌活性,PEDB是Pst10最适宜的液体培养基。在9种培养基中都能生长,在Vogel及Jackson培养基中生长良好但却没有抗菌物质生成,可见菌丝生长和抗菌物质生成之间没有必然相关性。抗菌物质生成的培养条件研究表明,接种量对抗菌物质生成没有影响,Pst10在20-37℃温度范围内都能代谢产生拮抗物质,但28℃是最适合的温度。装液量对抗菌物质的生成有影响,250mL三角瓶中装20-100mL液体培养基对青霉Pst10代谢产生抗菌物质没有明显差异,装液超过100mL,抗菌物质的生成减少,说明Pst10产生抗菌物质需要氧气。在最适培养条件下,Pstl0从第4天开始大量产生抗菌物质,第8天达到高峰,高峰期维持7-8天。对SLCF的抗菌活性检测方法开展了研究。在SLCF制备中发现,当接种量为1-4个菌饼时,用细菌滤膜过滤制备SLCF的抗菌活性显著低于用高速离心法获得SLCF的活性,部分抗菌物质被吸附在滤膜上,但这种差异随着接种量的增加而减小。推测可能接种量对Pst10的SLCF（?）勺总体活性没有明显影响,但对Pst10产生的抗菌物质的种类有影响：接种量小时,Pst10产生的抗菌物质中,易被细菌滤膜吸附的抗菌物质占较大比例；接种量大时,Pst10产生较多不被滤膜吸附的抗菌物质。由此可见Pst10代谢产生的抗菌物质是复杂多样的。采用平板打孔-抑菌圈法、含毒平板-菌丝生长抑制法及SLCF直接滴加三种方法对SLCF的抗菌活性进行检测,研究发现SLCF直接滴加法最灵敏；研究还发现,活性检测所用的培养基种类对检测结果有明显影响,SLCF在PDA上的抗菌活性大于在V8培养基上的活性。与平板法检测抗菌物质相比,薄层层析法（TLC）检测能获取更多信息,因为在检测的同时就对抗菌物质进行了初步的分离。通过观察薄层层析板上抑菌圈的数量及位置就可初步判断抗菌物质的大概有几大类及各类抗菌物质的相对极性强弱。将Pst10的PEDB培养液经纱布过滤,把滤液离心、真空浓缩100倍后用乙酸乙酯萃取获得抗菌物质粗提物；该粗提物经TLC分离后,在254nm紫外光线下观察到6条带,分别将6条带中的化合物回收后用辣椒疫霉进行生物测定,结果显示只有条带5有抗菌活性；将从条带5中回收的抗菌物质经硅胶柱层析,洗脱液中第5-8管有抗菌活性,将4管洗脱液合并浓缩后经HPLC分离,初步共收集到4组有活性的组分,改变洗脱条件,凸显有活性的洗脱峰,用HPLC制备型分离柱收集获得2个含量最大的活性组分fraction1和fraction5；将组分1和组分5进行’HNMR和13CNMR及二维NMR分析、紫外吸收光谱扫描,最后鉴定为Calbistrin A和CalbistrinB,二者互为同分异构体,分子式C31H40O8,分子量540.26。在中间每个分离步骤所得的活性物质中都能检测到Calbistrin A和Calbistrin B存在,说明二者均是由Pst10代谢产生。对常见微生物的生物活性测定显示：Calbistrin A和Calbistrin B对假单胞菌细菌没有活性,但对芽孢细菌有抗生活性,且Calbistrin B的活性显著高于Calbistrin A. Calbistrin A和Calbistrin B对辣椒疫霉孢子萌发的MIC分别为7.5μg/mL和1.25μg/mLCalbistrin B的活性是Calbistrin A的6倍。种子发芽实验显示,Calbistrin B的浓度对萝卜种子的发芽率及根长没有显著影响。采用根癌农杆菌介导的方法获得Pst10的潮霉素B抗性标记、遗传稳定的转化子41株,转化率为0.82%。所有转化子的生长速度和抗菌性能与野生型没有明显差异；获得12个绿色荧光蛋白-遗传霉素抗性（GFP-Gen）（?）双标记菌株,转化率0.24%,获得14个黄色荧光蛋白-遗传霉素（YFP-Gen）抗性双标记菌株,转化率0.28%。筛选到生长速度和拮抗性能与野生型没有明显差异的双标记转化子,为该菌株的专利保护实现了分子标记。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语及专有词汇检索表
• 第一部分 文献综述
• 第一章 植物土传病害的生物防治研究进展
• 1.土传病害的生防微生物种类
• 1.1 生防细菌
• 1.2 生防真菌
• 2.土传病害生物防治存在的问题及展望
• 参考文献
• 第二章 根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究
• 1.丝状真菌的遗传转化
• 2.根癌农杆菌介导遗传转化的特点
• 3.利用根癌农杆菌介导成功转化的丝状真菌
• 参考文献
• 第二部分 研究报告
• 第一章 辣椒疫病生防菌Penicillium striatisporum Pst10的筛选及其盆栽防效
• 1.材料与方法
• 1.1 供分离样品
• 1.2 培养基
• 1.3 微生物分离及培养
• 1.4 供试植物病原菌
• 1.5 辣椒疫霉拮抗菌的筛选
• 1.6 拮抗菌无菌培养滤液（sterilized liquid culture filtrates, SLCF）的制备
• 1.7 青霉Pst10抗菌谱的测定
• 1.8 青霉Pst10无菌培养滤液（SLCF）对辣椒疫霉的抗菌活性
• 1.9 青霉Pst10对辣椒疫病的盆栽防效
• 1.10 青霉Pst10的鉴定
• 2.结果分析
• 2.1 辣椒疫霉拮抗菌的筛选
• 2.2 青霉Pst10的抗菌谱
• 2.3 青霉Pst10的SLCF对辣椒疫霉的生物活性
• 2.4 有机肥对Pst10在辣椒根际定殖的影响
• 2.5 青霉Pst10对盆栽辣椒疫病的防效
• 2.6 Pst10鉴定结果
• 3.讨论
• 4.本章小结
• 参考文献
• 第二章 青霉Penicillium striatisporum Pst10的培养特征及抗菌物质生成的培养条件研究
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 青霉Pst10接种物的制备
• 1.3 辣椒疫霉菌的培养与接种物制备
• 1.4 青霉Pst10在不同固体培养基上的生长特征及最佳产孢培养基的筛选
• 1.5 青霉Pst10无菌培养滤液（SLCF）的制备
• 1.6 青霉Pst10液体培养抗菌物质生成的检测
• 1.7 青霉Pst10在不同液体培养基中的生长特征
• 1.8 拮抗物质生成的影响因子研究
• 1.9 最适条件下,Pst10液体培养的动态变化
• 2.结果分析
• 2.1 Pst10在五种不同培养基上的培养特征及最适产孢培养基
• 2.2 不同检测方法测定SLCF对辣椒疫霉的抗生活性
• 2.3 不同培养基检测SLCF的抗菌活性
• 2.4 不同制备方法获得的SLCF的抗菌活性
• 2.5 Pst10在9种不同液体培养基中的培养特征
• 2.6 青霉Pst10抗菌物质生成的影响因子研究
• 2.7 最适培养条件下Pst10生长及抗菌物质生成的动态变化
• 3.讨论
• 4.本章小结
• 参考文献
• 第三章 青霉Penicillium striatisporum Pst10抗菌物质的分离纯化及结构鉴定
• 1.材料与方法
• 1.1 培养基
• 1.2 青霉Pst10的种子培养物制备
• 1.3 青霉Pst10的液体培养
• 1.4 青霉Pst10液体培养滤液的有机溶剂提取物中抗菌物质的检测
• 1.5 抗菌物质的初步分离、检测
• 1.6 薄层层析展开剂的选择
• 1.7 抗菌物质Rf值的确定
• 1.8 抗菌物质的分离、纯化、鉴定
• 1.9 总体分离纯化程序
• 1.10 Calbistrin A、Calbistrin B对几种微生物的毒力测定
• 1.11 Calbistrin B对蔬菜种子的毒性测定
• 2.结果分析
• 2.1 青霉Pst10培养滤液的有机溶剂提取物中抗菌物质的活性检测
• 2.2 抗菌物质的初步分离
• 2.3 薄层层析展开剂的选择
• 2.4 抗菌物质Rf值的初步测定及大量样品的初分离
• 2.5 硅胶柱分离
• 2.6 HPLC分离
• 2.7 抗菌化合物的结构鉴定
• 2.8 Calbistrin A、Calbistrin B在各中间分离步骤中的存在状况检测
• 2.9 Calbistrin A、Calbistrin B对常见微生物的生物活性（MIC）
• 2.10 Calbistrin B对萝卜种子的生物毒性
• 3.讨论
• 4.本章小结
• 参考文献
• 第四章 根癌农杆菌介导的青霉Penicillium striatisporum Pst10的分子标记
• 1.材料与方法
• 1.1 菌株及质粒
• 1.2 培养基
• 1.3 青霉Pst10的培养
• 1.4 根癌农杆菌AGL-1介导的遗传转化
• 1.5 GFP/YFP—Gen抗性双标记菌株的发光表型观察
• 1.6 遗传标记菌株的基本生物学特性研究
• 1.7 遗传标记菌株的遗传稳定性研究
• 2.结果分析
• 2.1 青霉Pst10的潮霉素B抗性基因标记菌株的筛选
• 2.2 Pst10的GFP/YFP—Gen抗性双标记菌株的筛选
• 3.讨论
• 4.本章小结
• 参考文献
• 全文结论
• 研究创新点
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢