论文摘要
2型猪链球菌（Streptococcus suis serotype 2, S. suis 2）是一种重要的人畜共患传染病病原体。S. suis 2感染不仅可致猪急性败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎及急性死亡,并且可通过伤口和呼吸道等传播途径,导致人的感染发病和死亡。本病呈全球性分布,不仅给全世界养猪业造成巨大的经济损失,而且对相关从业人员的健康亦构成严重威胁,已成为重要的新发传染病病原体。1998年和2005年我国江苏省和四川省分别暴发大规模S. suis 2感染疫情,病人中出现高比例的、国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征（streptococcal toxic shock syndrome, STSS）,呈现高侵袭、深部组织感染的特点,病情凶险,病死率高（62.7%81.3%）,引发严重的公共卫生事件。为了对造成这两次突发感染事件的S. suis 2流行菌株的高致病性进行深入研究,本课题组对1998年江苏流行的强致病株98HAH12和2005年四川流行的强致病株05ZYH33（两株均分离自STSS病人）进行了全基因组测序和功能注释。将98HAH12和05ZYH33的基因组与Sanger研究中心公布的标准株P1/7全基因组序列进行共线性分析,结果发现有一个89 kb大小的核酸片段为98HAH12和05ZYH33这两个强致病株所特有,我们将这个特异性的片段命名为89K。随后对分离自这两次疫情爆发现场猪和人的15个菌株进行PCR扩增,结果均含有这段89K序列。有意义的是,国内无毒株和本室保存的国际标准株及各国分离的致病株均扩增不到该片段。进一步的生物信息学分析结果表明,这个89K具备典型的毒力岛（pathogenicity island, PAI）特征。这些结果强烈提示中国强致病株中的89K片段很可能是S. suis 2通过基因水平转移获得的一个毒力岛,使得原本没有毒力或者毒力较弱的菌株发生了毒力变异,从而引起这两次S. suis 2疫情大规模流行。然而,我们预测89K毒力岛完全是基于生物信息学分析的结果,缺乏足够的实验证据支持。为了从实验上证实89K这个潜在的毒力岛,我们对89K上的基因组织和分布进行了仔细分析,结果发现该片段上存在有2组二元信号转导系统（two-componentsignal transduction system, TCS）。大量研究表明,TCS作为致病菌中普遍存在的一种跨膜信号转导机制,在调节毒力基因表达和构成细菌致病性等方面发挥着重要的作用。鉴于此,为揭示89K这个疑似的毒力岛,阐明它与S. suis 05ZYH33强致病性的关系,本文将研究对象锁定在其中一个二元信号转导系统SalK/SalR上,对其进行了深入细致的生物学功能研究。其实验内容和结果主要包括以下几个方面:1. S. suis 05ZYH33高效电转化方法的建立:采用电穿孔的方法对S. suis 2强致病株05ZYH33进行外源DNA的转化,通过调整参数,对影响电转化效率的主要因素进行探索。结果在S. suis 05ZYH33中成功建立了一套高效稳定的电转化体系。在电转参数设置为22.5 kV/cm电场强度、500 ?电阻和25μF电容的条件下,用1 ng/μl的大肠杆菌—猪链球菌穿梭质粒pSET2可实现S. suis 05ZYH33的高效电转,转化效率可达107/μg DNA。同时发现壮观霉素抗性基因SpcR可以作为S. suis 2基因敲除实验中一个良好的筛选标记。2. S. suis 05ZYH33 SalK/SalR基因敲除突变株的构建:以S. suis 05ZYH33基因组DNA为模板,PCR扩增SalK/SalR编码基因的上下游片段;同时以pSET2穿梭质粒DNA为模板,PCR扩增壮观霉素抗性基因SpcR,在限制性内切酶和T4连接酶的作用下,将它们依次克隆到pUC18载体的多克隆位点上,形成一个在SpcR两侧具有与靶基因同源序列的SalK/SalR基因敲除载体pUC::salKR。将pUC::salKR电转化05ZYH33感受态细菌,筛选具有壮观霉素抗性的S. suis 2菌落,扩大培养后抽提基因组DNA,采用组合PCR验证和Southern杂交的方法证实SalK/SalR编码基因已被SpcR替换掉,从而获得具有壮观霉素抗性的SalK/SalR基因敲除突变株ΔsalKR。随后,PCR扩增出SalK/SalR编码基因及其上游启动子序列,并克隆至穿梭质粒pSET1,将重组质粒电转化突变株ΔsalKR,通过抗性筛选和PCR鉴定获得SalK/SalR功能代偿的互补株CΔsalKR。3. SalK/SalR缺失对细菌基本生物学性状的影响:在相同的条件下,观察S. suis 2野生株05ZYH33与突变株ΔsalKR的基本生物学性状有无明显差异。结果发现,SalK/SalR编码基因敲除后,细菌能稳定生长,壮观霉素抗性表型能够在突变株中稳定传代。同时,SalK/SalR的缺失未明显影响细菌的生长曲线、染色情况、结构形态、溶血活性以及对过氧化氢敏感性等生物学特性。但是与野生株05ZYH33相比,突变株ΔsalKR抵抗中细粒细胞杀菌的能力显著降低。4. SalK/SalR缺失对细菌毒力的影响:①用同等剂量（108 CFU）的野生株05ZYH33、突变株ΔsalKR、互补株CΔsalKR和无毒株05HAS68分别攻击长白仔猪。结果发现,野生株05ZYH33对动物有致死性,而SalK/SalR缺失的突变株则丧失了对宿主动物的致病性,互补株CΔsalKR能恢复对动物的强致病性。②用等比例的野生株/突变株混合菌感染长白仔猪,对易感组织中的细菌进行回收培养和计数,结果发现SalK/SalR缺失突变株在各组织中的定植能力严重下降。在与野生株共感染的情况下,突变株尚能在部分被检组织（扁桃体、心、肾和脑）中少量的定植,单纯用突变株进行感染则细菌完全不能在任何组织中定植。5. SalK/SalR调控S. suis 05ZYH33致病性的作用机制分析:利用CombiMatrix基因芯片比较SalK/SalR缺失前后细菌的基因表达谱差异,结合定量PCR对芯片数据结果进行验证。结果在突变株ΔsalKR中共发现26个显著下调的基因,主要编码物质的转运与代谢、DNA的重组修复和转录、膜蛋白以及一些功能未知的蛋白。同时发现2个潜在的毒力相关基因（05SSU1009和05SSU0451）,分别编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶和磷酸转移酶。综上所述,本研究为了从实验上证实S. suis 2中国强致病株中89K这个潜在的毒力岛,针对性地从该岛上选取了一个二元信号转导系统SalK/SalR作为研究对象,通过基因敲除技术获得了SalK/SalR缺失的突变株。体外实验显示SalK/SalR的缺失未明显影响细菌的生长、形态结构、溶血活性等基本性状,但是突变株抵抗中细粒细胞杀菌的能力显著降低。动物实验结果显示,SalK/SalR缺失后的突变株丧失了对宿主动物的致病性,而SalK/SalR功能互补的菌株能恢复对动物的强致病性,表明SalK/SalR对于S. suis 05ZYH33的强致病性是必不可少的,这在国际上还是首次报道SalK/SalR与细菌的毒力密切相关。基因芯片研究结果显示SalK/SalR的缺失会导致26个基因的转录出现显著的下调,其中有2个可能是潜在的毒力因子。本文研究结果不仅从实验上证实了毒力岛89K的客观真实性,同时也进一步促进了S. suis 2致病机理的深入认识。
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相关论文文献
- [1].2型猪链球菌双组分调控系统SalK/SalR抗吞噬机制的初步研究[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2013(06)
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