DcR3在食管鳞状细胞癌组织中的表达及相关机制研究

论文摘要

背景食管癌是人类八种最常见的恶性肿瘤之一。在全世界每年新增的30万病例中,约70 %发生在我国,并且其发病率仍呈上升趋势。食管癌总体预后不佳,总的2年和5年生存率分别为35%～42%和15%～24%。食管癌主要分为食管鳞状细胞癌（ESCC）和食管腺癌,而前者占了90%以上。因此,研究ESCC的发病机制,寻找其新的诊断和治疗靶点,已经成为提高食管癌预防和治疗效果的当务之急。在肿瘤的发生、发展中有一对矛盾贯穿始终,那就是机体的免疫监视和肿瘤的免疫逃逸。而诱导肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应和瘤细胞自身生长停滞或凋亡是机体用以清除肿瘤细胞的主要手段。LIGHT及FasL介导的凋亡是体内最常见的凋亡模式,在免疫调节和肿瘤的免疫监视中起着重要作用。DcR3是TNFRSF的一个新成员。研究发现,DcR3通过竞争性结合可以阻断经由其配体FasL、LIGHT以及TL1A所介导的肿瘤细胞的凋亡;同时DcR3还可抑制免疫应答中T细胞的增殖并影响DCs的分化和成熟,并抑制CD4+T细胞在混合淋巴细胞反应（MLR）中的增殖;此外,DcR3还可抑制T细胞的趋化效应,降低T细胞与抗原提呈细胞间的相互作用。研究显示,DcR3 mRNA低表达于正常人体组织中的胃、脊髓、淋巴结、肺、脾、结肠组织及多数造血细胞中,而高表达于胃肠道恶性肿瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胶质细胞瘤和淋巴瘤等多种恶性肿瘤中。研究证实,高表达DcR3是肿瘤细胞逃避机体免疫监视和杀伤的一个重要机制,其表达水平同多种肿瘤的进展程度、转移情况、对化疗的抵抗性以及不良预后有明显的相关性。因此,作为一种候选的肿瘤标志物和基因治疗标靶,DcR3目前已经成为了肿瘤诊断和治疗相关研究的热点。研究DcR3 mRNA和蛋白在人ESCC细胞系和ESCC病人组织标本中的表达情况并分析DcR3的表达与疾病的侵袭、转移、复发乃至预后间的关联性,将有助于评价DcR3作为ESCC的临床及预后的分子标志的可能性;而探讨其表达调控的可能机制则将有助于ESCC肿瘤基因治疗靶点的筛选。因此,关于DcR3在ESCC病人中的高表达及其相关机制的研究对于该疾病的防治有相当重要的意义。目的研究DcR3基因在ESCC病人肿瘤组织和相应的远癌组织中的表达情况,分析DcR3基因的表达与病人临床病理特征之间的关系,为评价DcR3作为ESCC的临床及预后的分子标志提供实验依据;检测DcR3基因启动子和编码区的多态性位点在重庆地区汉族ESCC人群中的基因型和等位基因频率,探讨DcR3启动子多态性与ESCC患病风险之间的关联,筛查与ESCC肿瘤组织中DcR3基因高表达相关联的SNP位点,为进一步研究和分析影响其表达调控的分子机制奠定基础;检测DcR3基因启动子区的甲基化状态差异,探讨ESCC肿瘤组织DcR3启动子甲基化状态是否参与其表达调控;考察DcR3 RNAi对ESCC肿瘤细胞的生长能力、侵袭能力和凋亡等方面的影响,初步探讨DcR3在人ESCC细胞发生和发展过程中可能作用和机制。方法1.收集109例ESCC肿瘤组织和对应的远癌组织标本,通过半定量逆转录聚合酶链反应（Semi-quantitative RT-PCR）检测其中DcR3 mRNA表达情况;2.运用免疫组织化学检测52例ESCC病人肿瘤组织中DcR3蛋白表达情况并行半定量分析;3.选取DcR3基因启动子和编码区四个多态性位点（-369G/T、-323A/C、-321C/T、147C/T）,通过PCR扩增产物测序的方法了解这些多态位点在重庆地区正常人群中的频率分布,检测上述多态位点在ESCC人群中的基因型和等位基因频率;4.选择4对DcR3 mRNA表达状态有明显差异的癌及相对应的远癌组织标本,利用重亚硫酸盐修饰后测序法（BSP）检测DcR3基因启动子区的甲基化状态;5.构建基于miR-30的、靶向DcR3的慢病毒干扰载体;6.用干扰载体、包装质粒pMD2G及包膜质粒psAX2共同转染293FT细胞进行病毒包装;7.通过流式细胞仪（FACS）感染后的KYSE150细胞,获得DcR3 RNAi的ESCC细胞模型;8.利用Real-time PCR和Western Blotting检测DcR3 RNAi后瘤细胞上DcR3的表达情况;9.绘制体外培养的感染细胞、对照细胞和亲本细胞的生长曲线;10.通过Transwell侵袭小室实验检测DcR3 RNAi与LIGHT-Fc协同作用对瘤细胞体外侵袭能力的影响;11.运用Tunel试剂盒检测DcR3 RNAi与LIGHT-Fc协同作用对瘤细胞凋亡的影响。结果1. ESCC肿瘤标本中DcR3 mRNA表达率为73.4%,而远癌组织为47.7%（p<0.01）;分析发现DcR3 mRNA的表达与病人的性别、年龄、部位和组织分化程度没有明显的相关性,而与肿瘤组织的外侵程度（p<0.05）、区域淋巴结转移情况（p<0.05）和临床TNM分期（p<0.05）有较强的相关性;2. ESCC肿瘤组织中DcR3蛋白的表达强弱与mRNA表达基本一致,DcR3的过表达率为28.8%;DcR3的过表达与ESCC病人区域淋巴结转移（p<0.05）和TNM分期（p<0.05）有明显的相关性;3.重庆地区汉族人群中-369G/T、-323A/C、-321C/T三个位点不存在多态性;而147C/T位点等位基因C的频率为43.7%,略高于中国汉族人（39.0%）和日本人（40.0%）。147C/T多态位点是与重庆地区汉族人群ESCC易感性相关联的一个风险位点,而且该多态位点的等位基因型C具有显性遗传效应,携带等位基因C的基因型CC和CT的ESCC发病风险显著增加（p<0.05）。但该多态位点与ESCC肿瘤组织中DcR3蛋白的异常高表达无明显的相关性;4. DcR3阳性的肿瘤组织和DcR3阴性的远癌组织,基因的启动子区的甲基化状态相同,即基因启动子区所有的CpG位点都呈非甲基化状态;5.成功设计并构建了基于miR-30的、靶向DcR3的慢病毒干扰载体;包装获得的病毒上清在体外能有效地感染人KYSE150细胞;6.经FACS分选,Western Blotting检测证实载体pPRIME-DcR3.3i能有效地抑制瘤细胞DcR3的蛋白表达,抑制率为82.6%;7. DcR3 RNAi对KYSE150细胞的体外生长无明显影响;8. DcR3 RNAi与LIGHT-Fc协同能有效地抑制瘤细胞的体外侵袭能力;9. DcR3 RNAi明显促进了LIGHT-Fc对KYSE150细胞的凋亡诱导。结论ESCC肿瘤组织中DcR3在mRNA和蛋白质水平较之对应的远癌组织存在明显的高表达,其高表达与肿瘤的区域淋巴结转移情况和临床TNM分期有较强的相关性。重庆地区汉族人群中147C/T位点是与ESCC易感性相关联的一个风险位点,该位点的等位基因型C具有显性遗传效应;ESCC病人肿瘤组织中DcR3的异常高表达与该基因CpG岛的甲基化状态异常无关; DcR3 RNAi对肿瘤细胞的体外生长没有直接的抑制效应,但能与LIGHT-Fc协同,有效地抑制瘤细胞的体外侵袭能力并促进对瘤细胞的凋亡诱导;DcR3对于ESCC是一个潜在的肿瘤生物标记。

论文目录

• 英文缩写词
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 DcR3 在食管鳞状细胞癌组织中的表达及相关机制研究
• 前言
• 第一部分：ESCC 肿瘤组织中DcR3 表达情况与临床病理特征间的关系研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分：ESCC 肿瘤组织中DcR3 高表达与启动子SNP 及CpG 岛甲基化状态关系的初步研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分：基于miR-30 的DcR3 慢病毒干扰载体的构建及其体外抑瘤作用的初步研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述 DcR3 及临床相关研究进展
• 参考文献
• 攻读学位期间发表及待发表的文章
• 英文论著