论文摘要
目的:研究不同来源成骨细胞体外培养的形态特征和生物学活性,探讨成骨细胞分离培养的最佳方法及作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值,为骨组织工程的研究提供稳定可靠的种子细胞来源。 方法:无菌条件下取新生新西兰兔胫骨骨膜和骨髓,PBS冲洗3次,0.25%胰蛋白酶消化20分钟,以彻底去除残留在组织块上的血污,再将骨膜剪成大小约为1×1mm的组织块,将骨膜组织块放入25ml培养瓶中,加入含10%小牛血清的高糖DMEM培养液2ml,细胞长满瓶底后进行传代培养。注射器肝素化后抽取完全DMEM培养液冲洗骨髓腔,将混合DMEM培养液加入到无菌离心管内,1000转/分钟离心,去除最上面的脂肪层,以1×106/cm2密度接种于100ml培养瓶中进行原代细胞培养。3天后全量换液,细胞汇合成单层后用0.25%胰蛋白酶消化细胞进行传代培养。细胞传代后改用含地塞米松（1×10（-8）mol/l）、β-甘油磷酸钠（10mmol/l）、维生素C（50mg/ml）的条件培养液培养。取第5代生长旺盛的成骨细胞,胰蛋白酶消化后,以107/ml的浓度封入冻存管进行超低温冻存,一个月后复苏,以106/ml的浓度接种在含有5mlDMEM培养液的培养瓶中培养。每种方法培养的细胞每日在相差显微镜下观察细胞的形态,通过Gomori钙钴法进行碱性磷酸酶染色,von Kossa法进行钙结节染色,观察细胞体外基质分泌和骨化过程。 结果:骨膜培养第3天可见少量的梭形细胞从组织块周围游出,随培养时间延长细胞数量逐渐增多,围绕组织块周围呈放射状生长,10天时细胞融合成单层。传代后的细胞呈梭形、多角形,带有粗大的突起,4天时
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