卵巢癌肝脾转移动物模型的建立及转染CD40L基因抗卵巢癌肝转移作用的体内实验研究

论文摘要

目的:卵巢癌是一种常见的,死亡率极高的妇科恶性肿瘤,目前主要采用手术、放疗、化疗相结合的治疗方法,虽治疗手段有了较大进步,但疗效并不乐观。恶性肿瘤的发生发展与机体的免疫功能低下有关,目前免疫基因治疗越来越受到重视。CD40配体（CD40L）是一种免疫调节分子,CD40L与CD40结合能有效刺激T细胞增殖分化,增强其特异性杀伤肿瘤细胞的作用,还可诱导T细胞分泌细胞因子,从而发挥抗肿瘤作用。本课题旨在建立小鼠肝脾转移动物模型的基础上,探讨转染CD40L基因的卵巢癌细胞株OVHM（CD40L-OVHM）脾脏接种后体内抗肿瘤效应的机制,为CD40L的临床应用提供实验依据。方法:1用MTT法测定CD40L-OVHM细胞、OVHM细胞和空载体DNA-pMKITneo-OVHM细胞的生长曲线,应用倒置显微镜观察三种细胞的形态。2用流式检测仪检测CD40L在CD40L-OVHM细胞和OVHM细胞的表达情况。3用HE染色法验证经小鼠脾内接种OVHM细胞建立肝转移模型的可行性。4经小鼠脾脏内接种肿瘤细胞建立肝转移模型分为四组:OVHM细胞组、空载体DNA-pMKITneo-OVHM细胞组、CD40L-OVHM细胞组及注射PBS液组。于小鼠脾脏接种肿瘤细胞后第10天用流式细胞仪分析不同组脾细胞CD11c分子的表达情况来反映树突状细胞（DC）的数量。于小鼠脾脏接种肿瘤细胞后第10天用MTT法检测不同组脾脏杀伤性T细胞（CTL）的杀伤活性。于小鼠脾脏接种肿瘤细胞后第14天用ELISA法检测不同组小鼠外周血血清中细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10和IL-12）的含量。于小鼠脾脏接种肿瘤细胞后第14天称量小鼠肝脏和脾脏的重量及观察肝脏转移瘤结节的情况。最后每组余下10只小鼠用于观察生存期。结果:1镜下观察OVHM细胞、CD40L-OVHM细胞和DNA-pMKITneo-OVHM细胞三种细胞形态无明显区别,测定三种细胞的生长增殖情况无明显差异。2 CD40L-OVHM细胞表面大量表达CD40L分子,而OVHM细胞未见CD40L表达。3小鼠脾脏内接种肿瘤细胞OVHM细胞后第14天脾脏接种局部出现原发肿瘤,肝脏表面可见大量转移瘤结节,病理学证实小鼠肝脏和脾脏的肿瘤结节的病理学形态结构相似,可见肝脾转移动物模型建立成功。4接种OVHM细胞、DNA-pMKITneo-OVHM细胞和CD40L-OVHM细胞后10天的小鼠脾细胞中CD11c阳性细胞率均明显高于PBS对照组（P<0.05）,CD40L-OVHM细胞组小鼠的脾细胞中CD11c阳性细胞率（20.30±1.23%）与DNA-pMKITneo-OVHM细胞组和OVHM细胞组小鼠脾细胞相比较（10.69±0.89%和10.56±0.85%）有显著性提高（P<0.05）。5不同组小鼠的脾脏细胞毒性T细胞（CTL）杀伤活性检测结果显示:CD40L-OVHM细胞组、OVHM细胞组和DNA-pMKITneo-OVHM细胞组的小鼠脾细胞CTL杀伤率均高于PBS组（P<0.05）,CD40L-OVHM组对OVHM细胞的杀伤能力明显高于OVHM组和DNA-pMKITneo-OVHM组（P<0.05）,OVHM组和DNA-pMKITneo-OVHM组间无显著性差异（P>0.05）。6 CD40L-OVHM组血清TNF-α、IL-12和IFN-γ浓度明显高于DNA-pMKITneo-OVHM细胞组和OVHM细胞组（P<0.05）;CD40L-OVHM组血清IL-4和IL-10浓度明显低于OVHM组和DNA-pMKITneo-OVHM组（P<0.05）。OVHM组和DNA-pMKITneo-OVHM组间血清TNF-α、IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10浓度均无明显差异（P>0.05）。7小鼠脾内接种肿瘤细胞发生肝转移和脾脏原发瘤情况:小鼠脾脏接种肿瘤细胞后第14天,DNA-pMKITneo-OVHM细胞组和OVHM细胞组小鼠均出现肝转移,脾脏均有原发瘤,肝脏平均重量分别为3.07±0.19g,3.10±0.21g;脾脏平均重量分别为1.25±0.14g,1.23±0.16g,两组之间无显著性差异。CD40L-OVHM细胞组小鼠中有3只小鼠发生了肝转移（3/10）,肝脏平均重量为1.45±0.14g;所有接种CD40L-OVHM细胞的小鼠脾脏均出现原发瘤,脾脏平均重量为0.58±0.10g。CD40L-OVHM细胞组小鼠的肝脏和脾脏重量均轻于OVHM细胞组和DNA-pMKITneo-OVHM细胞组肝脾的重量（P<0.05）,但与PBS对照组相比,OVHM细胞组、DNA-pMKITneo-OVHM细胞组和CD40L-OVHM细胞组的小鼠肝脏和脾脏重量均明显增加（P<0.05）。8对照组PBS组小鼠在试验期间无一死亡,OVHM细胞组和DNA-pMKITneo-OVHM细胞组的小鼠在试验观察期（65天）全部死亡,平均生存期分别为17±1天和18±1天;CD40L-OVHM细胞组的小鼠到实验结束时有6只死亡,其余4只在结束实验时仍然存活,平均生存期为58±3天,明显长于OVHM细胞组和DNA-pMKITneo-OVHM细胞组（P<0.05）。结论:1通过建立小鼠肝脾转移动物模型证实表达CD40L的OVHM细胞（CD40L-OVHM）的体内抑瘤作用明显。2表达CD40L的OVHM细胞（CD40L-OVHM）能够有效地促进脾脏DC的增殖和分化,增强脾脏细胞毒性T细胞（CTL）的特异性杀伤活性,增强机体局部抗肿瘤作用。3表达CD40L的OVHM细胞（CD40L-OVHM）能够有效地调节外周血细胞免疫功能,通过增强Th1型细胞的功能,抑制Th2型细胞的功能有效地调节了机体的Th1细胞和Th2细胞的平衡,增强了机体的抗肿瘤作用。4为进一步研究CD40L基因瘤苗及CD40L的临床应用提供了一定的试验基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 研究论文 卵巢癌肝脾转移动物模型的建立及转染CD40L基因抗卵巢癌肝转移作用的体内实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 个人简历