论文摘要
背景:肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是病因不清,进展迅速的神经变性病,除力如太能延缓病程数月外,尚无特效治疗。目前的研究认为ALS属于异质性疾病,而从尸检材料到动物试验,再到细胞试验,从散发的ALS到基因突变的模型,均证实线粒体在ALS发病中起到了重要的作用。而既往的研究发现脑缺血后神经保护剂丁苯酞（3-n-butylphthalide,NBP）具有线粒体保护作用,它可以减轻低糖低氧损伤造成的线粒体膜流动性降低,线粒体膜电位下降及线粒体总ATPase活性改变。鉴于NBP的作用途径和ALS的发病机制间存在交叉点,我们通过细胞试验初步探讨NBP对ALS是否具有保护作用。ALS虽属于异质性疾病,但谷氨酸通过α-氨基羟甲基恶唑丙酸（alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid,AMPA）受体产生的兴奋性毒性作用在ALS发生发展中起了重要作用得到广泛认可。谷氨酸的AMPA受体属于离子型通道,过去认为AMPA受体不能透过钙离子,激活AMPA受体后仅引起钠离子内流,而钠离子内流可以使细胞膜去极化进一步引起电压门控的钙离子通道引起钙离子内流,现在的研究认为AMPA分为钙透性受体和非钙透性受体两种,且认为钙透性AMPA受体的兴奋性毒性导致了ALS的发生。目的:在以上的研究背景下,我们对NBP治疗ALS进行了研究。本论文可分为两个部分,第一部分中我们选择了AMPA作为造模工具药,观察NBP对ALS的保护作用。论文第二部分基于钙离子在AMPA损伤中起了关键作用这一理论,并根据AMPA受体分为钙透性受体和非钙透性受体,而经钙透性型受体直接进入的钙离子对ALS的发病其关键作用这一特点,对AMPA造成的神经元内钙离子浓度变化及NBP对钙离子浓度的影响进行分析,探讨NBP可能的作用机制。方法:第一部分中,以乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）和线粒体膜电位作为损伤指标,从细胞坏死和凋亡两个方面观察AMPA对神经元的损伤及NBP的保护作用。取出生24小时的乳鼠大脑皮层制成单细胞悬液,在无血清神经元特异性培养剂中培养至第6～7天,以AMPA造成细胞损伤,取细胞外培养剂,用LDH检测试剂盒检测LDH含量,比较AMPA是否能造成LDH升高及NBP是否对该升高具有抑制作用。对于线粒体膜电位的观察使用荧光指示剂JC-1,以荧光酶标仪检测红绿荧光强度的比值,观察各组间差异,探讨AMPA是否能够造成线粒体膜电位下降及NBP是否对其下降有抑制作用。第二部分中,以Fura-2am为研究手段,首先观察了AMPA在细胞外液含钠时处理神经细胞,对细胞内游离钙的升高作用及NBP对钙离子浓度变化的影响。之后去除细胞外液中的钠离子成分,以除外非钙透性AMPA受体间接造成的钙离子升高,观察NBP对直接由钙透性AMPA受体引起的游离钙浓度变化的影响,探讨NBP可能的作用机制。结果:1、AMPA处理神经元可以使LDH升高,说明AMPA能造成细胞膜通透性增高,同时AMPA能造成线粒体膜电位下降,提示AMPA能诱导细胞产生凋亡。而NBP能够使LDH升高及线粒体膜电位下降的幅度减低,说明NBP对于AMPA造成的细胞损伤具有保护作用,LDH是细胞坏死的指标,而线粒体膜电位是细胞凋亡的早期指标,两个指标从坏死凋亡两个方面反应了NBP对AMPA造成细胞损伤的保护作用。2、AMPA能够升高细胞内钙离子,而NBP能抑制AMPA造成的细胞内的钙离子升高。进一步的分析发现NBP处理组的钙离子浓度均值低于空白对照组,提示NBP可能对钙离子稳态起了直接的影响。在无钠液中,未加AMPA刺激时,NBP处理细胞,会造成细胞游离钙浓度下降,证实了NBP对细胞内钙离子稳态的作用。之后以AMPA处理细胞,NBP组和单纯AMPA组钙离子荧光强度均有升高,但NBP组的升高幅度小于单纯AMPA组,提示NBP对于经过钙离子可透性受体引起的钙离子浓度升高可能具有直接的抑制作用。结论:通过本试验,可以观察到AMPA能够造成神经元损伤,细胞坏死及细胞凋亡机制可能均参与其中,而NBP对于AMPA所造成的损伤具有抑制作用,以LDH和线粒体膜电位的结果,可以推测其对坏死和凋亡均具有抑制作用。通过NBP对钙离子的影响,发现NBP可以影响细胞的钙离子稳态,其作用是下调细胞内钙离子浓度,其作用机制可能与以往研究的NBP抑制毒胡萝卜素造成的内质网重吸收钙离子障碍有关。NBP除了对于内质网吸收钙离子有作用外,对于经激活钙可透性AMPA受体进入细胞内的钙离子也起到了抑制作用。