外源p204和cbfa1对斑马鱼胚胎发育和骨生成的影响

论文摘要

骨骼有两个明显的特征：一是广泛分布于躯体并且组成骨骼的元件形状形态具有独特性,二是骨骼由两种不同的组织（成骨和软骨）组成。骨骼的形成主要通过软骨内成骨（endochondral ossification）和膜内成骨（intramembranous ossification）两种方式。脊椎动物骨骼的生成是一个复杂并高度有序的过程。作为转录生长因子runt/Cbfa家族的一个成员,Cbfal（runx2）通过其runt结构域结合到DNA上激活成骨细胞中骨钙蛋白基因的表达。在成骨分化过程中,p204作为Cbfa1的辅助激活因子共同促进成骨细胞的分化。BMP2诱导间充质细胞C2C12向成骨细胞分化过程中,p204表达量增加；p204,Cbfa1和pRb蛋白组成三元复合体共同参与了成骨细胞分化的过程。模式动物斑马鱼因其个体小、性成熟周期短、体外受精和发育、胚体透明容易观察、便于显微操作等优势,现已用于发育生物学相关研究,取得了许多进展。目前,虽然斑马鱼还没有广泛应用于骨发育和相关疾病的研究,但已有许多研究证明了其可行性。斑马鱼骨骼可以分头部骨骼、躯体骨骼和鳍三种,在骨骼生成与发育过程中有着从头到尾的有序骨化的过程,头部首先形成,接着躯干骨化,与躯干骨化的同时鳍逐渐形成。Manuel等认为斑马鱼的鳍质鳞条虽然不是一个典型的骨骼组织,但其再生过程对于骨组织功能紊乱的临床前研究具有重要的意义。我们以斑马鱼为模式动物,采用显微注射的方式将外源p204和cbfa1导入其单细胞胚胎内,通过观察胚胎中融合蛋白GFP的荧光表达,发现两种融合质粒在斑马鱼胚胎中从8 hpf时期开始表达,表达位置主要集中在胚胎的胸腹部,头部和尾鳍处有较少表达。胚胎发育至8 dpf时,荧光表达量开始减少,约12 dpf后荧光彻底消失。两种质粒p204-EGFP和cbfal-EGFP注射诱导斑马鱼幼鱼产生大量畸形,以腹部膨大、脊椎弯曲、心胸部变异、尾部弯曲变短、头部畸形等为主。这些较严重畸形幼鱼只有少部分可存活下去。通过qPCR检测发现外源p204和cbfa1单独注射都可以诱导斑马鱼骨骼生成相关标志基因和关键基因osx, vent,tcf7表达量显著上调,而p204和cbfa1双质粒注射组相关基因的表达量高于任一单独注射组。进一步通过原位杂交检测OSX,tcf7在质粒注射后的时空表达,研究结果表明这两个基因表达时间提前,并且表达区域也有所扩展。同时,外源p204和cbfa1都可以诱导促进斑马鱼软骨,特别是pharyngeal arches软骨的分化,刺激成骨的形成,与相关成骨基因表达量高于单独注射组结果类似,在促进骨骼的生长和软骨的分化过程中,双质粒注射组结果也更加明显。研究表明：1.外源p204和cbfa1都可以参与斑马鱼骨骼生成分化过程中,并在一定程度上促进或更改（造成畸形发育）这一进程：2.p204可以促进cbfa1（或runx2b）作为骨骼生长中心因子参与骨骼生成,二者共同作用促进斑马鱼硬骨形成。本研究为进一步以斑马鱼为模式动物阐明以runx2b为中心的骨骼发生相关的分子机制提供了依据。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 1.前言
• 1.1 脊椎动物骨骼发育
• 1.2 cbfa1与p204的生物学作用
• 1.3 模式动物斑马鱼
• 1.4 研究思路与意义
• 2.实验材料与方法
• 2.1 实验材料试剂与仪器
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要实验试剂
• 2.1.3 主要实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 斑马鱼饲养与繁殖
• 2.2.2 p204-EGFP和cbfa1-EGFP质粒扩增与线性化
• 2.2.3 显微注射
• 2.2.4 胚胎发育观察统计
• 2.2.5 骨发育相关基因表达检测
• 2.2.6 斑马鱼幼鱼整体骨染色
• 3.实验结果
• 3.1 p204-EGFP和cbfa1-EGFP质粒扩增、线性化与纯化结果
• 3.2 荧光率和胚胎畸形率观察统计结果
• 3.3 骨发育相关基因qPCR检测结果
• 3.4 osx和tcf7基因ISH检测结果
• 3.5 斑马鱼幼鱼整体骨染色结果
• 4.讨论
• 4.1 p204和cbfa1导致斑马鱼胚胎发育和骨发生异常
• 4.2 外源基因p204和cbfa1注射后斑马鱼基因表达模式
• 4.3 对斑马鱼runx2在骨发生中的关键作用研究展望
• 4.4 相关研究方法注意事项
• 5. 结论
• 参考文献
• 附录
• 硕士期间其他研究工作（一）
• 硕士期间其他研究工作（二）
• 致谢
• 硕士期间发表论文
• 学位论文评阅及答辩情况表