胰高血糖素受体的生物化学及生物物理特性分析 ——胞外区的重组表达、结晶筛选和功能测定

论文摘要

胰高血糖素（Glucagon, Gc）是人体内调节血糖浓度的重要肽类激素之一其主要生理作用是通过调节糖异生和糖原分解来升高血糖。胰高血糖素的受体（Glucagon receptor, GCGR）在人体各种组织器官中广泛分布,但主要位于肝细胞膜表面,是G蛋白偶联受体（G prote in co up led receptor, GPCR）超家族中家族B的典型代表,属于七次跨膜蛋白,其胞外区（Extracelluar domain, ECD）是与胰高血糖素结合的主要结构域。现在有很多研究认为人体内胰高血糖素浓度过高是促使糖尿病发生发展的重要因素,甚至被认为是2型糖尿病病理生理过程中的中心环节。已经在糖尿病动物模型中证实胰高血糖素受体的拮抗性抗体或小分子可以明显降低血糖浓度,因此拮抗胰高血糖素的作用可能成为治疗2型糖尿病的新领域。获得胰高血糖素受体与其配体结合的结构信息,不仅可以揭示这类重要受体发挥功能的分子机制,更加有助于我们更好地设计出合理的药物,应用于糖尿病及其他代谢病的治疗。因此,我们期望可以解析胰高血糖素受体胞外区（GCGR-ECD）及其与胰高血糖素结合的结构,并应用于生物医药领域。在本论文中,作者综合运用了各种表达及纯化手段,尝试了大肠杆菌表达系统和昆虫细胞表达系统。最终在大肠杆菌Origami B宿主菌中纯化出MBP（麦芽糖结合蛋白,Maltose binding protein）融合的GCGR-ECD重组蛋白,并且创新性的将胰高血糖素小肽融合在此蛋白的羧基末端（命名为GCGR-ECD-Gc）,使Glucagon可在分子内部与GCGR-ECD结合。另一方面,作者在昆虫表达系统中分泌性表达了GCGR-ECD,并筛选出了一种可以大大提高蛋白表达量的信号肽。作者第一次在体外应用等温量热滴定法（Isothermal titration calorimetry, ITC）检测了重组GCGR-ECD蛋白与胰高血糖素的结合力,原核表达蛋白的平衡解离常数值（Kd）为7.6μM,真核蛋白则为6.6μM,并用ITC证明了MBP融合的GCGR-ECD-Gc蛋白可以在分子内部形成受体-配体的结合,是进行下一步X射线晶体学研究的良好对象。作者通过各种生物物理方法检测了各类重组蛋白质的二级结构特点及稳定性,并大量尝试了结晶筛选。虽然结晶实验没有成功,但作者发现这类重组蛋白结晶困难的主要因素。最后,作者提出了可能的改进方法以及手段,可供后续研究参考。本论文在阐述GCGR-ECD的研究之后总结了目前GPCR研究领域的进展,包括GPCR的最新研究方法,以及各类GPCR的结构生物学研究概况。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 主要英文缩略表
• 第一章 前言
• 第一节 胰高血糖素及其受体的生理功能
• 第二节 胰高血糖素在2型糖尿病发病及治疗中的重要性
• 第三节 胰高血糖素受体的结构生物学研究意义
• 第二章 胰高血糖素受体胞外区在大肠杆菌系统的表达及纯化
• 第一节 整体实验方法和基本性质预测
• 第二节 实验方法
• 2.2.1 GCGR-ECD不同截短体蛋白在大肠杆菌BL21的表达纯化
• 2.2.2 DsbC融合的GCGR-ECD蛋白在大肠杆菌BL21的表达纯化
• 2.2.3 MBP融合蛋白在大肠杆菌Origami B的表达纯化
• 2.2.4 硫酸铵沉淀法纯化大肠杆菌二硫键异构酶DsbC
• 第三节 实验结果
• 2.3.1 非融合性蛋白的表达结果
• 2.3.2 DsbC融合蛋白的表达及纯化结果
• 2.3.3 MBP融合的GCGR-ECD以及GCGR-ECD-Gc蛋白表达及纯化
• 第四节 实验结论
• 第三章 胰高血糖素受体胞外区在昆虫系统的表达
• 第一节 实验方法
• 3.1.1 GCGR-ECD（27-136）截短体在昆虫细胞内的表达
• 3.1.2 GCGR-ECD在昆虫细胞系统的分泌性表达及纯化
• 3.1.3 GCGR-ECD其他截短体以及突变体在昆虫细胞系统的分泌性表达
• 第二节 实验结果
• 3.2.1 GCGR-ECD（27-136）在昆虫细胞内的表达及纯化
• 3.2.2 GCGR-ECD（27-136）在昆虫系统的分泌性表达以及信号肽筛选
• 3.2.3 GCGR-ECD其他截短体及突变体在昆虫系统的分泌性表达
• 第三节 实验结论
• 第四章 重组GCGR-ECD蛋白的生物化学性质检测及分析
• 第一节 实验方法
• 4.1.1 等温滴定量热法
• 4.1.2 分子筛Superdex75检測去糖基化蛋白与胰高血糖素的相互作用
• 第二节 实验结果
• 4.2.1 ITC检测结果
• 4.2.2 分子筛检测GCGR-ECD蛋白与胰高血糖素的相互作用
• 第三节 实验结论
• 第五章 重组GCGR-ECD蛋白的生物物理性质检测以及结晶
• 第一节 重组GCGR-ECD蛋白的生物物理性质检测
• 5.1.1 实验方法
• 5.1.2 实验结果
• 第二节 悬滴气相扩散法筛选蛋白质结晶条件
• 5.2.1 实验方法
• 5.2.2 实验结果
• 第三节 实验结论
• 第六章 讨论
• 第一节 胰高血糖素受体胞外区的重组表达特点
• 第二节 胰高血糖素受体胞外区的结晶困难
• 第三节 胰高血糖素受体胞外区对其配体亲和力的讨论
• 第四节 胰高血糖素受体的结构生物学研究展望
• 综述 G蛋白偶联受体的结构生物学研究进展
• 第一节 G蛋白偶联受体概述
• 第二节 家族A GPCR的结构生物学研究
• 第三节 家族B GPCR胞外区结构的研究概述
• 第四节 家族C GPCR的结构生物学研究简述
• 参考文献
• 在读期间发表论文
• 致谢