醋酸甲羟孕酮的单克隆抗体及ELISA检测技术研究

论文摘要

动物性食品卫生问题,尤其是兽药残留问题,已成为人们广泛关注的焦点之一,也是引起国际贸易中经济纠纷的主要起因。2002年,欧盟发生的醋酸甲羟孕酮（Medroxy progesterone acetate,MPA）饲料污染事件再次给世界各国政府食品安全管理部门和消费者敲响了警钟,引起国际上的强烈反响。MPA是一种人工合成的孕激素类药物,为了提高经济效益,将MPA作为安情助长药物在畜牧养殖业中使用。但长期大量使用可导致动物性食品中MPA残留,对消费者的健康造成潜在威胁,可能引起乳腺癌、不孕不育症等不良反应,欧盟等很多国家已明令禁止将MPA用于食源性动物的任何用途,但MPA仍被一些国家仍允许使用。因此,加强MPA残留的监控和进出口相关产品的检验势在必行。本研究通过制备抗MPA的单克隆抗体,建立了MPA残留检测的间接竞争ELISA方法,具体结果如下:1.根据MPA的分子结构,利用肟化反应和酰化反应构建一个含有羧基4个碳原子的分子间隔臂,将MPA与盐酸羟胺、琥珀酸酐依次反应获得含有羧基的MPA衍生物;再分别通过碳二亚胺法、混合酸酐法将含有羧基的MPA衍生物偶联到载体蛋白BSA和OVA上合成人工抗原,Balb/c小鼠免疫试验和ELISA检测筛选表明人工抗原具有良好的免疫原性和反应原性,成功合成了MPA的一种免疫抗原（MPA-BSA）与一种包被抗原（MPA-OVA）,SDS-PAGE和紫外扫描鉴定表明,合成人工抗原MPA-BSA与MPA-OVA中MPA与载体蛋白的偶联比分别为12∶1和8∶1,为下一步MPA单克隆抗体的制备提供了理想材料。2.以MPA-OVA作为包被检测抗原,以三免后抗体阳性小鼠血清、生理盐水组小鼠血清分别为阳性对照和阴性对照,通过对包被条件、封闭条件、终止条件、二抗浓度和各步的反应时间的选择,确立了用于抗MPA抗体检测和单克隆抗体阳性筛选的ELISA和间接竞争抑制ELISA操作体系。用MPA-BSA按免疫程序,进行Balb/c小鼠第四次免疫,经间接ELISA检测,选择免疫效果最好的小鼠10 d后加强免疫,按照实验室常规单克隆抗体（McAb）制备与鉴定方法,进行细胞融合、阳性筛选、克隆亚克隆、腹水制备以及McAb特性鉴定,获得了一株生长稳定、分泌抗体效价高的抗MPA McAb杂交瘤细胞株M68F9。经检测制备的抗MPA McAb特异性强、敏感性高、亲和力高,属于IgG1亚类,细胞培养上清中抗MPA McAb间接ELISA效价不低于1∶1 500,腹水中McAb的间接ELISA效价不低于1∶1×107;抗MPA McAb与甲地孕酮交叉反应率为25%,与其他常见残留兽药莱克多巴胺、克伦特罗、己烯雌酚的交叉反应率均小于0.01%,其MPA的半数抑制浓度（IC50）为2～4 ng/mL,为进一步开展MPA免疫学分析技术的研究奠定了基础。3.利用亲和层析法-Protein G Sepharose 4 Fast Flow对抗MPA McAb进行了纯化,经SDS-PAGE鉴定与间接ELISA抗体活性检测,获得了具有良好的纯度与活性的纯化抗MPA McAb。在抗MPA McAb阳性筛选ELISA反应条件的基础上,以MPA-BSA为包被原,以纯化的抗MPA McAb为检测抗体,通过对包被溶液、封闭液和抗体稀释液、酶标二抗稀释度、竞争反应体系和显色时间等条件的优化,确立了用于MPA检测的间接竞争ELISA方法。并对建立的间接竞争ELISA方法进行了灵敏度、特异性、精密度和保存期等指标的测定,同时与国外进口的MPA检测试剂盒（5131MPA1p[3]08.05）进行了比较和初步应用试验。结果表明,所建立的间接竞争ELISA最低检测限在0.1～0.5 ng/mL,IC50为3.3914 ng/mL,线性检测范围在1～80 ng/mL（R2=0.9925）;除与甲地孕酮交叉反应率为25%外,与其他结构的兽药没有交叉反应;检测方法具有良好的可重复性,批内变异系数为3.70%,批间的变异系数为4.00%;在2～8℃条件下抗原包被板保存期不低于6个月。所建立的方法与进口试剂盒的相关参数相近,初步应用试验的检测结果两种方法完全相符,表明所建立的ELISA方法可以满足MPA残留分析的需求。本研究通过对MPA的人工抗原合成与其McAb制备的研究,首次以MPA单克隆抗体为基础,成功地建立了可用于MPA检测的ELISA方法,为MPA残留免疫学检测技术研究提供了良好的技术平台,同时也为我国自主知识产权的MPA检测EIA试剂盒的组装生产奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 兽药残留及其研究进展
• 1.1 兽药残留的概念与种类
• 1.1.1 兽药残留的概念
• 1.1.2 引起兽药残留的常见兽药
• 1.2 兽药残留的危害
• 1.2.1 毒性作用
• 1.2.2 过敏和变态反应
• 1.2.3 致癌、致畸、致突变作用
• 1.2.4 破坏胃肠道菌群平衡
• 1.2.5 细菌耐药菌株的产生
• 1.2.6 对临床用药的影响
• 1.2.7 兽药残留对生态环境的影响
• 1.3 兽药残留的监控
• 1.3.1 欧盟食品中兽药残留物监控法规制定和发展
• 1.3.2 管理机构
• 1.4 兽药残留检测方法
• 1.4.1 兽药残留检测方法定义
• 1.4.2 兽药残留检测方法分类
• 1.5 我国兽药残留现状与兽药残留监控
• 1.6 兽药残留产生原因分析
• 1.6.1 非法使用违禁或淘汰药物
• 1.6.2 不遵守休药期规定
• 1.6.3 滥用药物
• 1.6.4 违背有关标签的规定
• 1.6.5 屠宰前用药和贮藏用药
• 1.7 小结与展望
• 第二章 醋酸甲羟孕酮与小分子物质免疫学分析
• 2.1 欧盟激素甲羟孕酮污染事件
• 2.1.1 MPA 事件起因
• 2.1.2 MPA 污染产品调查
• 2.1.3 欧盟的对策
• 2.1.4 MPA 事件的启示
• 2.2 醋酸甲羟孕酮（MPA）的研究进展
• 2.2.1 孕激素与MPA
• 2.2.2 MPA 的临床应用与研究
• 2.2.3 MPA 在畜牧业应用与研究
• 2.2.4 MPA 残留的危害性
• 2.2.5 MPA 的检测方法
• 2.3 小分子物质的免疫学分析技术
• 2.3.1 免疫半抗原的衍生
• 2.3.2 人工抗原的合成鉴定
• 2.3.3 抗体制备
• 2.3.4 免疫学分析方法
• 2.4 本研究的背景、路线和目的意义
• 试验研究
• 第三章 醋酸甲羟孕酮人工抗原的研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 仪器
• 3.1.3 试验动物
• 3.2 方法
• 3.2.1 人工抗原的合成
• 3.2.2 人工抗原的鉴定
• 3.3 结果
• 3.3.1 人工抗原合成结果
• 3.3.2 人工抗原反应原性检测结果
• 3.3.3 人工抗原免疫原性检测结果
• 3.3.4 人工抗原免疫原性检测结果
• 3.3.5 人工抗原SDS-PAGE 鉴定
• 3.3.6 MPA 人工抗原的紫外线扫描鉴定结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 抗原与半抗原
• 3.4.2 人工抗原的合成
• 3.4.3 人工抗原的鉴定
• 3.5 小结
• 第四章 MPA 单克隆抗体的制备与鉴定
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 器械和器皿
• 4.1.4 实验动物和细胞
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 动物免疫
• 4.2.2 抗体检测
• 4.2.3 单克隆抗体的制备
• 4.2.4 单克隆抗体特性鉴定
• 4.3 结果
• 4.3.1 间接ELISA 方法的优化结果
• 4.3.2 免疫效果检测
• 4.3.3 单克隆抗体细胞株的建立
• 4.3.4 单克隆抗体特性的鉴定
• 4.4 讨论
• 4.4.1 半抗原与单克隆抗体
• 4.4.2 动物免疫对单克隆抗体制备的影响
• 4.4.3 阳性杂交瘤细胞的筛选
• 4.4.4 单克隆抗体的特性鉴定
• 4.5 小结
• 第五章 MPA 检测间接竞争ELISA 方法的研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 试剂
• 5.1.2 仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 单克隆抗体的纯化
• 5.2.2 抗原包被检测MPA 间接竞争ELISA 方法的建立
• 5.2.3 保存期试验
• 5.2.4 间接竞争ELISA 的初步检测应用
• 5.3 结果
• 5.3.1 MPA 单克隆抗体的纯化鉴定
• 5.3.2 抗原包被检测MPA 间接竞争ELISA 方法的建立
• 5.3.3 保存期试验
• 5.3.4 间接竞争ELISA 的初步检测应用
• 5.4 讨论
• 5.4.1 单克隆抗体的纯化
• 5.4.2 抗原包被MPA 检测ELISA 方法
• 5.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 中英文对照
• 致谢
• 作者简介