利迪链菌素高产菌株选育及生物合成研究

论文摘要

为了提高利迪链菌素的发酵水平,对利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)进行了选育改良,通过LC/MS分析,研究了高产突变株过度表达的原因及利迪链菌素的生物合成途径,并在30 L发酵罐上进行了放大培养,取得了如下结果:基于生物合成前体的代谢抑制/阻遏作用,筛选前体的抗性/忍耐突变株,其原理在于只有生物合成途径发生了改变、消除了代谢抑制/阻遏作用的突变株才能生长,因此具有有效性状的突变株而被筛选到;筛选的正向突变率达83.5%,其中丙酸盐抗性突变株P28的产量提高了267%。通过LC/ESI–MS检测,采用全扫描、选择离子扫描、ESI–MS、MS/MS和二极管矩阵(PDA)等检测模式,对比分析了突变株P28及其出发菌株的代谢产物。结果显示,两个分支途径的阻断及一个中间产物积累的显著下降导致了突变株P28的过度表达,且这一中间产物(m/z 363.1 [M– H]ˉ)是承接利迪链菌素的聚酮部分与Tetramic acid部分生物合成的关键途径中间产物。应用LC/MS/MS技术研究了利迪链菌素的生物合成途径。首先基于同位素标记的研究,提出多条生物合成的可能路线;S. lydicus代谢产物的ESI–MS谱中以选择离子扫描模式进行分子量搜索,确定了唯一的生物合成路线,并对其中化合物的结构进行特征确认。由已知结构的终产物利迪链菌素及各化合物的MS/MS或MS~3碎片离子信息、亚结构断点位置,鉴别了17个途径中间产物的结构,阐明了利迪链菌素聚酮部分及Tetramic acid部分的生物合成途径。糖代谢是利迪链菌素发酵过程调控的关键,葡萄糖对S. lydicus代谢的pH、菌浓及利迪链菌素合成的影响非常敏感,针对这些代谢特点,以菌浓为基准在30 L发酵罐上进行了放大培养,发酵过程探索采用了葡萄糖、氨水和pH的串级调控策略,调控与菌体的代谢没有滞后性,各参数控制非常稳定,可使发酵液的糖浓度、pH、菌浓及补氨水量达到最佳的控制,利迪链菌素的平均发酵水平提高了52.7%。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 提高微生物次级代谢产物水平的方法
• 1.2.1 菌种选育提高菌株的合成能力
• 1.2.1.1 随机筛选法
• 1.2.1.2 推理选育法
• 1.2.1.3 原生质体融合技术
• 1.2.1.4 基因工程技术改良菌种
• 1.2.1.5 核糖体工程
• 1.2.2 过程控制优化提高产物水平
• 1.2.2.1 统计学试验设计优化过程参数
• 1.2.2.2 发酵过程的模拟优化
• 1.2.2.3 C、N 及P 的代谢调控
• 1.3 代谢产物的分析方法
• 1.3.1 微生物代谢产物的分析
• 1.3.1.1 GC/MS 分析代谢产物
• 1.3.1.2 LC/MS 分析代谢产物
• 1.3.2 高产突变株的代谢差异分析方法
• 1.3.2.1 高产突变株的代谢通量分析
• 1.3.2.2 二维凝胶电泳分析高产突变株的蛋白质组
• 1.4 生物合成途径的研究进展
• 1.4.1 生物合成途径的研究方法
• 1.4.1.1 同位素标记法
• 1.4.1.2 阻断变株法
• 1.4.1.3 基因工程技术
• 1.4.1.4 LC/MS 研究生物合成
• 1.4.2 聚酮生物合成的研究
• 1.4.2.1 Ⅰ型PKS
• 1.4.2.2 Ⅱ型PKS
• 1.5 本文的立题背景、意义及主要研究内容
• 第二章 消除代谢抑制/阻遏作用选育S. lydicus AS 4.2501
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌种和培养基
• 2.2.2 主要仪器与试剂
• 2.2.2.1 主要仪器
• 2.2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 分析方法
• 2.2.3.1 发酵液的菌体干重测定及发酵滤液萃取
• 2.2.3.2 杯碟法测定利迪链菌素的含量
• 2.2.3.3 HPLC 测定利迪链菌素的含量
• 2.2.3.4 发酵液中还原糖的测定
• 2.2.4 试验方法
• 2.2.4.1 前体对利迪链菌素生物合成的抑制/阻遏影响
• 2.2.4.2 复合诱变处理
• 2.2.4.3 单孢子悬浮液的制备
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 前体物质对S. lydicus 生长的最低抑菌浓度（MIC）
• 2.3.2 复合诱变对S. lydicus 的影响
• 2.3.3 丙酸钠、缬氨酸、葡萄糖抗性/忍耐突变株的筛选
• 2.3.4 高产菌株P28 代谢产物的HPLC 分析
• 2.3.5 高产菌株P28 在2 L 发酵罐上的代谢分析
• 2.4 小结
• 第三章 LC/ESI–MS 对比分析高产突变株的过度表达
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种、培养基及培养条件
• 3.2.2 主要仪器及试剂
• 3.2.3 分析方法
• 3.2.4 高产突变株P28 过度表达的分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 高产突变株P28 与出发菌株代谢产物的对比分析
• 3.3.2 高产突变株P28 过度表达的分析
• 3.3.3 高产突变株P28 与出发菌株的利迪链菌素差异分析
• 3.4 小结
• 第四章 单个及组合抗生素抗性筛选P28 的高产菌株
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种和培养基
• 4.2.2 主要仪器及试剂
• 4.2.3 分析方法
• 4.2.4 试验方法
• 4.2.4.1 单孢子悬浮液的制备
• 4.2.4.2 复合诱变处理
• 4.2.4.3 五种抗生素对S. lydicus 最小抑菌浓度的测定
• 4.2.4.4 抗生素抗性突变株的分离
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 五种抗生素对出发菌株的最小抑制浓度
• 4.3.2 吖啶橙对出发菌株P28 生长的影响
• 4.3.3 单个和组合链霉素、红霉素、林可霉素、左氧氟沙星、环丙沙星抗性突变对利迪链菌素生物合成的影响
• 4.3.3.1 自发突变条件下五种药品单个和组合的抗性筛选
• 4.3.3.2 复合诱变条件下五种抗生素单个和组合的抗性筛选
• 4.3.4 高产菌株L8 的代谢产物分析
• 4.4 小结
• 第五章 利迪链菌素30 L 发酵罐上的放大培养及提取纯化
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌种及培养基
• 5.2.2 主要仪器及试剂
• 5.2.3 分析方法
• 5.2.4 试验方法
• 5.2.4.1 30 L 发酵罐的培养
• 5.2.4.2 发酵液的絮凝剂处理
• 5.2.4.3 发酵滤液的乙酸乙酯萃取
• 5.2.4.4 利迪链菌素的正己烷结晶
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 放大培养的利迪链菌素生物合成
• 5.3.1.1 发酵放大的培养基优化
• 5.3.1.2 基于菌浓放大的利迪链菌素生物合成
• 5.3.1.3 pH 调控对利迪链菌素生物合成的影响
• 5.3.1.4 葡萄糖、氨水和pH 的串级调控策略
• 5.3.2 利迪链菌素的萃取结晶工艺
• 5.3.2.1 发酵液的絮凝处理
• 5.3.2.2 利迪链菌素的乙酸乙酯萃取工艺
• 5.3.2.3 利迪链菌素的正己烷结晶工艺
• 5.3.2.4 利迪链菌素成品质量分析
• 5.4 小结
• 第六章 利迪链菌素聚酮生物合成的研究（Streptolol 部分）
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 菌种、培养基及培养条件
• 6.2.2 主要仪器及试剂
• 6.2.3 LC/MS/MS 分析发酵液萃取物
• 6.2.4 Streptolol 部分可能的生物合成途径
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 利迪链菌素Streptolol 部分生物合成路线的确定
• 6.3.2 Streptolol 部分9 个途径中间产物的结构鉴别
• 6.4 小结
• 第七章 LC/MS/MS 研究Tetramic acid 部分的生物合成
• 7.1 引言
• 7.2 材料与方法
• 7.2.1 菌种、培养基及培养条件
• 7.2.2 主要仪器及试剂
• 7.2.3 LC/MS/MS 分析发酵液萃取物
• 7.2.4 利迪链菌素Tetramic acid 部分可能的生物合成途径
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 LC/ESI–MS 确定Tetramic acid 部分的生物合成路线
• 7.3.2 Tetramic acid 部分的生物合成途径
• 7.3.3 MS/MS 分析用于8 个途径中间代谢产物的结构鉴别
• 7.3.4 Tetramic acid 环的糖化修饰
• 7.4 小结
• 第八章 结论与展望
• 8.1 结论
• 8.2 展望
• 8.3 本文创新点
• 参考文献
• 博士在读期间发表的论文和参加科研情况
• 致谢