HCMV UL144和UL145基因在低传代临床分离株中结构和表达的初步研究

论文摘要

目的:本文主要研究HCMV UL144和UL145基因在低传代临床分离株中的多态性并检测它们mRNA的表达情况,为研究它们的多态性与先天性HCMV感染不同致病性之间的关系奠定基础,为揭示这两个基因编码产物的功能和先天性HCMV感染的致病机理提供更丰富的资料。 方法:从先天性感染HCMV的新生儿尿液中分离出HCMV病毒,接种至生长良好的人胚肺成纤维细胞中;收集感染病毒后出现病变的细胞;抽提病毒DNA,根据GeneBank公布的HCMV Toledo株UL144和UL145基因全序列及有关文献,从临床毒株DNA中扩增分离出UL144和UL145基因片段,并克隆入pMD18-T载体;对重组体进行测序鉴定;应用生物信息学方法分析它们的多态性;抽提病毒RNA,通过RT-PCR技术检测UL144和UL145基因mRNA的表达情况。 结果:从HCMV的低传代临床分离株PCR扩增出UL144和UL145基因全序列,克隆到pMD18-T载体并测序。不同临床分离株UL144基因与Toledo株进行同源性比较,结果核苷酸水平为98.5～99.2%,氨基酸水平为98.6～99.4%;UL145基因与Toledo株的核苷酸同源性为97.2～97.8%,氨基酸水平为97.8～98.5%。从HCMV临床分离株的细胞培养物中均能检测到UL144和UL145基因mRNA的表达。 结论:成功分离了4株HCMV临床分离株,并从中扩增了HCMV UL144和UL145基因并克隆,验证了UL144和UL145基因的多态性;并首次在体外培养人胚肺成纤维细胞中检测到UL145 mRNA的表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 一. 前言
• 1. HCMV背景简介
• 1.1 HCMV的病毒学特征
• 1.2 病毒感染的致病机理
• 1.3 病毒的复制
• 1.4 HCMV感染临床症状
• 1.5 HCMV的诊断及治疗
• 2. UL144、UL145基因简介
• 3. 课题意义
• 二. 技术路线
• 三. 实验仪器与材料
• 1. 主要仪器
• 2. 实验材料
• 2.1 细胞和菌种
• 2.2 主要试剂
• 2.3 其它主要试剂的配方
• 四. 实验方法
• 1. HCMV的分离和培养
• 1.1 病毒的收集
• 1.2 病毒的分离
• 1.3 病毒的培养
• 2. 病毒DNA的提取
• 3. HCMV低传代临床分离株鉴定
• 3.1 引物的设计
• 3.2 PCR扩增
• 4. UL144基因的扩增、克隆
• 4.1 UL144基因的扩增
• 4.2 UL144基因的克隆
• 4.3 UL144克隆质粒测序
• 5. UL145基因的扩增、克隆
• 5.1 UL145基因的扩增
• 5.2 UL145基因的克隆及测序
• 6. HCMV总RNA的提取
• 7. HCMV RNA的纯化
• 8. HCMV RNA的鉴定
• 8.1 鉴定RT-PCR引物设计
• 8.2 HCMV mRNA逆转录成cDNA
• 8.3 PCR鉴定HCMV IE基因mRNA
• 9. UL144基因的RT-PCR扩增
• 10. UL145基因的RT-PCR扩增
• 五. 结果与分析
• 1. 病毒的分离与培养
• 1.1 人胚肺成纤维细胞培养结果
• 1.2 感染病毒后人胚肺细胞出现病变效应
• 2. HCMV的鉴定
• 3. PCR扩增UL144、UL145基因
• 3.1 PCR扩增UL144基因
• 3.2 PCR扩增UL145基因
• 4. UL144、UL145基因的克隆
• 4.1 UL144基因的克隆
• 4.2 UL145基因的克隆
• 4.3 UL144、UL145基因克隆结果鉴定
• 5. 克隆质粒pMD18-UL144、pMD18-UL145的鉴定
• 5.1 克隆质粒pMD18-UL144的鉴定
• 5.2 克隆质粒pMD18-UL145的鉴定
• 6. HCMV RNA的提取
• 7. 通过RT-PCR技术鉴定HCMV mRNA的表达
• 8. UL144、UL145基因表达的鉴定
• 8.1 UL144基因表达的鉴定
• 8.2 UL144基因RT-PCR产物的克隆鉴定
• 8.3 UL145基因的表达鉴定
• 8.4 UL145基因RT-PCR产物的克隆及鉴定
• 9. HCMV UL144、UL145基因核苷酸和氨基酸序列分析结果
• 9.1 核苷酸序列及其编码蛋白氨基酸序列的多态性
• 9.2 编码蛋白翻译后修饰位点分析结果
• 9.3 HCMV UL144、UL145编码蛋白质性质预测
• 9.4 UL144和UL145基因编码蛋白质二级结构和功能预测
• 六. 讨论
• 1. 病毒的分离和培养
• 2. 病毒的鉴定
• 3. UL144和UL145基因的PCR扩增
• 4. 病毒mRNA的检测
• 5. UL144和UL145基因核苷酸和氨基酸序列分析
• 6. UL145开放阅读框编码产物分析
• 七. 小结
• 八. 附录
• 附录1 GeneBank公布的UL144基因全序列
• 附录2 GeneBank公布的UL145基因全序列
• 附录3 UL144基因全长测序结果（一）
• 附录4 UL144基因全长测序结果（二）
• 附录5 UL145基因全长测序结果（一）
• 附录6 UL145基因全长测序结果（二）
• 九.参考文献
• 致谢