不同利用方式对红壤坡地硝化功能微生物多样性的影响

论文摘要

本文采集了中国科学院桃源农业生态试验站红壤坡地农田、自然恢复和茶园土壤样品,采用DNA提取、PCR扩增、末端限制性酶切片段长度多态性分析（T-RFLP）技术、克隆文库构建等分子生物学技术研究不同利用方式对土壤氨氧化古菌和氨氧化细菌amoA基因多样性以及菌群组成的影响。结果表明,土壤氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）多样性指数差异不显著,且在3种不同十地利用方式中呈现相同的趋势,均为农田=茶园>自然恢复。通过RDA分析,发现不同利用方式造成土壤理化性状的改变是影响土壤AOA和AOB群落结构的主要原因。好气培养法测得不同土壤硝化势农田最高,茶园次之而自然恢复最低。相关性分析显示,硝化势与AOA和AOB amoA基因多样性指数呈显著正相关关系,其中与AOA amoA基因关系最为密切。与GenBank的数据比对结果显示克隆到的氨氧化古菌amoA基因主要与未培养的Crenarcheota（泉古菌门）,其余的序列属于unclassified Archaea（未分类的古菌）,克隆到的氨氧化细菌都属于Nitrosospira菌属。总体来说,红壤坡地不同利用方式改变了土壤AOA和AOB的多样性以及群落组成。并进一步证实土壤AOB和AOA积极参与了土壤的硝化过程,且AOA在氨氧化微生物群落生态功能中占有重要地位,AOA比AOB与硝化势的关系更为密切。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 研究目的与意义
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 不同土地利用方式对土壤氮流失的影响
• 1.2.2 不同环境对硝化功能微生物多样性的影响
• 1.2.3 土壤硝化作用过程及其功能基因
• 1.2.4 氨氧化细菌和氨氧化古菌在硝化过程中的作用
• 1.2.5 土壤微生物多样性研究方法进展
• 1.3 研究内容、研究方案与技术路
• 1.3.1 研究内容与目标
• 1.3.2 研究方案
• 1.3.3 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 土壤样品
• 2.1.1 土壤样品背景
• 2.1.2 土壤样品采集与预处理
• 2.1.3 土壤理化性质测定
• 2.2 土壤DNA的提取
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 提取方法
• 2.3 氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）amoA基因的扩增及条件优化
• 2.3.1 仪器与试剂
• 2.3.2 方法
• 2.3.3 PCR扩增及条件优化
• 2.4 氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）amoA基因的酶切反应和T-RFLP检测
• 2.4.1 材料
• 2.4.2 方法
• 2.4.2.1 PCR产物纯化
• 2.4.2.2 酶切反应和T-RFLP检测
• 2.4.2.3 T-RFLP分析
• 2.5 氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）amoA基因的克隆与序列分析
• 2.5.1 材料
• 2.5.2 方法
• 2.5.2.1 PCR产物的纯化（同2.4.2.1）
• 2.5.2.2 克隆
• 2.5.2.3 测序及序列分析
• 2.5.2.4 文库分析
• 2.6 核苷酸序列登录号
• 3 结果与分析
• 3.1 土壤微生物总DNA提取
• 3.1.1 DNA的质量
• 3.1.2 DNA质量的检测
• 3.2 不同利用方式下氨氧化古菌和氨氧化细菌的多样性及组成
• 3.2.1 氨氧化古菌和氨氧化细菌的PCR扩增
• 3.2.2 T-RFLP分析氨氧化古菌和氨氧化细菌的多样性及组成
• 3.2.2.1 酶切检测
• 3.2.2.2 不同土地利用方式AOA和AOB多样性变化
• 3.2.2.3 不同利用方式对硝化势的影响
• 3.2.2.4 硝化势与多样性的关系
• 3.2.2.5 不同利用方式对AOA和AOB群落的影响
• 3.2.2.6 土壤理化性状对AOA和AOB分布的影响
• 3.3 克隆文库构建与系统发育树
• 3.3.1 目的基因片段的克隆与测序分析
• 3.3.2 文库分析
• 3.3.2.1 多样性指数分析
• 3.3.2.2 稀疏曲线、库容及优势种分析
• 3.3.2.3 文库显著性差异分析
• 3.3.2.4 系统发育树分析
• 4 讨论
• 4.1 土壤微生物总DNA提取
• 4.2 不同利用方式对氨氧化功能微生物多样性的影响
• 4.3 不同利用方式氨氧化古菌和氨氧化细菌amoA基因的系统发育分析
• 5 全文结论
• 参考文献
• 符号表
• 致谢
• 个人简历