PI3K/Akt信号转导途径在肿瘤细胞放射增敏中作用的实验研究

论文摘要

PI3K/Akt信号转导途径在肿瘤细胞放射增敏中作用的实验研究目的：探讨肿瘤细胞PI3K/Akt信号转导途径在多西紫杉醇（docetaxel）、顺铂（cisplatin）和塞来昔布（celecoxib）放射增敏中作用的分子机制；研究通过抑制肿瘤细胞PI3K/Akt信号转导途径提高docetaxel、cisplatin和celecoxib放射增敏的效果。方法：体外培养人宫颈癌HeLa细胞和人乳腺癌MCF-7细胞。实验分为9组：对照组、单纯照射组、LY294002联合照射组、docetaxel联合照射组、cisplatin联合照射组、celecoxib联合照射组、LY294002联合docetaxel照射组、LY294002联合cisplatin照射组、LY294002联合celecoxib照射组。应用适当浓度药物增敏作用24h后X线照射，RT-PCR检测Bad、COX-2、Ku70、Ku80、NF-κB mRNA的表达；Western blot检测Bad、pBad、Akt、pAkt、COX-2蛋白的表达；流式细胞仪检测不同处理组细胞凋亡率变化；应用中性彗星电泳检测不同处理组细胞DNA的损伤；细胞克隆集落形成法测定HeLa细胞和MCF-7细胞放射增敏效果；应用单击多靶模型拟合细胞存活曲线，计算不同处理组Dq、D0、SF2和放射增敏比（sensitization enhancement ratio，SER）。结果：在HeLa细胞中：（1）LY294002联合docetaxel、cisplatin、celecoxib照射组Bad mRNA的表达增高，COX-2、Ku70、NF-κB mRNA的表达减低，Ku80 mRNA的表达无明显变化；（2）LY294002联合docetaxel、cisplatin、celecoxib照射组Bad蛋白表达增高，COX-2、pAkt、pBad蛋白表达减低；Akt蛋白表达无明显变化；（3）celecoxib能够抑制COX-2、NF-κB mRNA表达，并抑制COX-2、pAkt、pBad蛋白表达；（4）LY294002联合docetaxel、cisplatin、celecoxib照射组细胞凋亡率明显高于单纯药物增敏照射组；（5）LY294002联合药物增敏照射组Dq、D0、SF2明显低于单纯药物增敏照射组，LY294002联合docetaxel照射组SER是单用docetaxel照射组的1.35倍，LY294002联合cisplatin照射组SER是单用cisplatin照射组的1.26倍，LY294002联合celecoxib照射组SER是单用celecoxib照射组的1.22倍；（6）LY294002联合药物增敏照射组彗星电泳尾距明显长于单纯药物增敏照射组。在MCF-7细胞中：（1）LY294002联合药物增敏照射组Dq、D0、SF2明显低于单纯药物增敏照射组，LY294002联合docetaxel照射组SER是单用docetaxel照射组的1.47倍，LY294002联合cisplatin照射组SER是单用cisplatin照射组的1.03倍，LY294002联合celecoxib照射组SER是单用celecoxib组照射的1.22倍；（2）LY294002联合docetaxel、cisplatin、celecoxib照射组pAkt蛋白表达减低；Akt蛋白表达无明显变化；（3）LY294002联合docetaxel、cisplatin、celecoxib照射组细胞凋亡率明显高于单纯药物增敏照射组。结论：（1）docetaxet和cisplatin药物增敏照射能够明显活化PI3K/Akt信号转导途径，PI3K/Akt信号转导途径的活化是细胞内的一个早期反应事件。（2）celecoxib药物增敏照射抑制PI3K/Akt信号转导途径活化。（3）抑制PI3K/Akt信号转导途径能够提高docetaxel、cisplatin和celecoxib对HeLa细胞和MCF-7细胞放射增敏的效果。（4）抑制PI3K/Akt信号转导途径，能够从以下三个方面提高药物增敏放射治疗的效果：①抑制Ku70减少细胞DNA损伤后的再修复；②通过抑制COX-2、NF-κB的表达，抑制细胞的分裂增殖；③提高促凋亡因子Bad的表达，促进细胞的凋亡。第一部分放射增敏对人宫颈癌HeLa细胞PI3K/Akt信号转导途径影响的研究目的：探讨多西紫杉醇（docetaxel）、顺铂（cisplatin）和塞来昔布（celecoxib）在放射增敏过程中对人宫颈癌HeLa细胞PI3K/Akt信号转导途径的影响。方法：体外培养HeLa细胞，MTT法检测药物（docetaxel、cisplatin和celecoxib）作用24h对HeLa细胞的半数抑制浓度（IC50）；实验分为5组：对照组、单纯照射组、docetaxel联合照射组、cisplatin联合照射组、celecoxib联合照射组；应用适当浓度药物增敏作用24h后X线6Gy照射，1h后应用western blot法和免疫荧光法检测不同处理组磷酸化Akt（pAkt）蛋白的表达。结果：（1）HeLa细胞药物作用24h的IC50分别为：docetaxel 8.82±2.36μg/mL，cisplatin 12.04±2.58μg/mL，celecoxib 185.74+46.62μmol/L；（2）western blot法检测pAkt蛋白的表达（相对灰度）：对照组0.1553±0.0019、单纯照射组0.3630±0.0037、docetaxel联合照射组0.5121±0.0113、cisplatin联合照射组0.4909±0.0052、celecoxib联合照射组0.2076±0.0029，各组间存在统计学差异（F=2168.521，P＜0.05）；（3）免疫荧光检测显示：pAkt蛋白在细胞浆中表达，尤以靠近细胞膜处荧光最强。docetaxel联合照射组和cisplatin联合照射组pAkt蛋白荧光强于单纯照射组，celecoxib联合照射组pAkt蛋白荧光低于单纯照射组。结论：X线照射后PI3K/Akt信号转导途径出现活化；docetaxel和cisplatin药物增敏照射能够明显活化PI3K/Akt信号转导途径；celecoxib药物增敏照射抑制PI3K/Akt信号转导途径活化。第二部分抑制PI3K/Akt信号转导途径提高HeLa细胞放射增敏效果的研究目的：研究抑制PI3K/Akt信号转导途径提高docetaxel、cisplatin和celecoxib对HeLa细胞放射增敏的效果。方法：实验分为9组：对照组、单纯照射组、LY294002联合照射组、docetaxel联合照射组、cisplatin联合照射组、celecoxib联合照射组、LY294002联合docetaxel照射组、LY294002联合cisplatin照射组、LY294002联合celecoxib照射组。应用适当药物浓度增敏作用24h后X线照射，细胞克隆集落形成法测定HeLa细胞放射增敏效果，应用单击多靶模型拟合细胞存活曲线，计算不同处理组Dq、D0、SF2和放射增敏比（SER）；应用中性彗星电泳检测不同处理组细胞DNA的损伤。结果：（1）LY294002联合药物增敏照射组Dq、D0、SF2明显低于单纯药物增敏照射组，LY294002联合docetaxel照射组SER是单用docetaxel照射组的1.35倍，LY294002联合cisplatin照射组SER是单用cisplatin照射组的1.26倍，LY294002联合celecoxib照射组SER是单用celecoxib照射组的1.22倍；（2）LY294002联合药物增敏照射组HeLa细胞彗星电泳尾距明显长于单纯药物增敏照射组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：抑制PI3K/Akt信号转导途径能够提高docetaxel、cisplatin和celecoxib对HeLa细胞放射增敏的效果，提高射线对细胞DNA的损伤。第三部分抑制PI3K/Akt信号转导途径提高HeLa细胞放射增敏效果的机制研究目的：探讨抑制P13K/Akt信号转导途径提高docetaxel、cisplatin和celecoxib对HeLa细胞放射增敏效果的分子机制。方法：实验分为9组：对照组、单纯照射组、LY294002联合照射组、docetaxel联合照射组、cisplatin联合照射组、celecoxib联合照射组、LY294002联合docetaxel照射组、LY294002联合cisplatin照射组、LY294002联合celecoxib照射组。应用适当药物浓度增敏作用24h后X线照射6Gy，RT-PCR检测Bad、COX-2、Ku70、Ku80、NF-κB mRNA的表达；Western blot检测Bad、pBad、Akt、pAkt、COX-2蛋白的表达；流式细胞仪检测不同处理组细胞凋亡率变化。结果：（1）LY294002联合docetaxel、cisplatin、celecoxib照射组Bad mRNA表达增高，COX-2、Ku70、NF-κB mRNA表达减低，Ku80 mRNA表达无明显变化；（2）LY294002联合docetaxel、cisplatin、celecoxib照射组Bad蛋白表达增高，COX-2、pAkt、pBad蛋白表达减低；Akt蛋白表达无明显变化；（3）celecoxib能够抑制COX-2、NF-κB mRNA的表达，并抑制COX-2、pAkt、pBad蛋白的表达；（4）LY294002联合docetaxel、cisplatin、celecoxib照射组细胞凋亡率明显高于单纯药物增敏照射组。结论：抑制PI3K/Akt信号转导途径，能够从以下三个方面提高药物增敏放射治疗的效果：（1）抑制Ku70减少细胞DNA损伤后的再修复；（2）通过抑制COX-2、NF-κB的表达，抑制细胞的分裂增殖；（3）提高促凋亡因子Bad的表达，促进细胞的凋亡。第四部分抑制PI3K/Akt信号转导途径对人乳腺癌MCF-7细胞药物放射增敏影响的研究目的：抑制PI3K/Akt信号转导途径提高docetaxel、cisplatin和celecoxib对人乳腺癌MCF-7细胞放射增敏的效果。方法：实验分为9组：对照组、单纯照射组、LY294002联合照射组、docetaxel联合照射组、cisplatin联合照射组、celecoxib联合照射组、LY294002联合docetaxel照射组、LY294002联合cisplatin照射组、LY294002联合celecoxib照射组。应用适当药物浓度增敏作用24h后X线照射，细胞克隆集落形成法测定MCF-7细胞放射增敏效果；应用单击多靶模型拟合模型拟合细胞存活曲线，计算不同处理组Dq、D0、SF2和放射增敏比（SER）；应用western blot法检测pAkt和Akt蛋白的表达；应用流式细胞仪检测不同处理组细胞凋亡率变化。结果：（1）LY294002联合药物增敏照射组Dq、D0、SF2明显低于单纯药物增敏照射组，LY294002联合docetaxel照射组SER是单用docetaxel照射组的1.47倍，LY294002联合cisplatin照射组SER是单用cisplatin照射组的1.03倍，LY294002联合celecoxib照射组SER是单用celecoxib照射组的1.22倍；（2）LY294002联合docetaxel、cisplatin、celecoxib照射组pAkt蛋白表达减低；Akt蛋白表达无明显变化；（3）LY294002联合docetaxel、cisplatin、celecoxib照射组细胞凋亡率明显高于单纯药物增敏照射组。结论：抑制PI3K/Akt信号转导途径能够提高docetaxel、cisplatin和celecoxib对MCF-7细胞放射增敏的效果。

论文目录

• 一、英文缩略词表
• 二、中文摘要
• 三、英文摘要
• 四、正文
• 前言
• 第一部分:放射增敏对人宫颈癌HeLa细胞PI3K/Akt信号转导途径影响的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分:抑制PI3K/Akt信号转导途径提高HeLa细胞放射增敏效果的研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分:抑制PI3K/Akt信号转导途径提高HeLa细胞放射增敏效果的机制研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分:抑制PI3K/Akt信号转导途径对人乳腺癌MCF-7细胞药物放射增敏影响的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 五、总结
• 六、综述
• 七、附录 发表文章
• 八、致谢