人CD26/DPPⅣ基因片段的克隆与鉴定

论文摘要

CD26/DPPⅣ分子是一种高度糖基化的Ⅱ型跨膜蛋白,由两个同源亚单位组成,通过N末端亲水区结合在细胞膜上。人CD26/DPPⅣ基因定位于2号染色体长臂24区,约90kb,含26个外显子,在上游非编码区没有TATA盒或CAAT盒,GC丰富区域含有转录因子结合位点,肝细胞核因子能够激活转录。CD26/DPPⅣ由766个氨基酸残基组成,分子量约ll0KD,胞内肽链极短,仅有6个高度保守的氨基酸序列,跨膜区含22个氨基酸,胞膜外段由738个氨基酸组成,可分为三个结构域:①N末端糖基化区:与跨膜区相连的20个氨基酸形成可弯曲的“茎”区,其后的区域含9个糖基化位点。②富含半胱氨酸区:③C末端催化区:CD26/DPPⅣ属于丝氨酸蛋白酶家族,此家族成员催化部位具有相似的氨基酸序列“Gly-Xaa-Ser-Xaa-GIv”。CD26/DPPⅣ第628-632位氨基酸“Gly-Trp-Ser-Try-Glv”为其催化序列,推测Ser-630为催化残基。CD26/DPPⅣ蛋白有很多生物学功能,在刺激T细胞活化、抑制前列腺癌细胞恶化、抗HIV感染等方面都发挥重要作用。它又是一种蛋白水解酶,能降解肽链N末端第二个残基上的脯氨酸或甘氨酸,产生N端二肽,故称二肽基肽酶。由于该分子的催化活性中心不受糖基化区域的影响,因此我们拟采用RT-PCR方法获得含有人CD26/DPPⅣC末端催化区141个氨基酸的cDNA片段,并构建一个原核表达载体,我们命名为pET-28a-hCD26,通过在大肠杆菌BL21中的表达和蛋白纯化分析,鉴定重组蛋白的酶学活性和抗原性。用hDPPⅣ抗原多肽免疫动物,获得实验动物的抗血清,通过ELISA方法检测抗血清的特异性和效价,最终制备CD26/DPPⅣ的多克隆抗体,进一步探讨CD26/DPPⅣ抗体在诊断前列腺癌方面的临床应用价值。

论文目录

• 内容提要
• 中英文对照表
• 第一章 引言
• 一、CD26 基因和蛋白质结构
• 二、CD26 在组织和细胞上分布特点
• 三、CD26 及其同系物
• 四、CD26 与 T 细胞活化
• 五、CD26 介导的信号转导机制
• 六、CD26 与 CD45
• 七、CD26 与 ADA
• 八、CD26 与 HIV
• 九、CD26 与肿瘤
• 第二章 材料和方法
• 一、材料
• 二、方法
• 第三章 结果
• 一、引物设计
• 二、PCR 产物琼脂糖凝胶电泳
• 三、PCR 产物与pGEM-T Easy 重组质粒及酶切结果
• 四、测序结果及分析
• 五、原核表达质粒pET-28a 转化、扩增、提取
• 六、重组质粒pET-28a-hCD26 连接、转化、扩增、酶切鉴定
• 七、重组质粒pET-28a-hCD26 测序图及结果分析
• 八、重组质粒pET-28a-hCD26 转化BL21 细胞及质粒酶切鉴定
• 九、蛋白质分析软件预测蛋白质二级结构和理化性质
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 致谢