NDV分离株的遗传变异分析与McAb1E5模拟抗原表位的筛选

论文摘要

新城疫病毒（NDV）引发的新城疫（ND）是禽类的一种接触性、烈性传染病,发病急,感染率和死亡率高,给养禽业带来严重的经济损失。NDV表面的血凝素-神经氨酸酶（HN）是主要的免疫保护性抗原,与病毒的毒力和致病性密切相关。从病鸡输卵管积液中分离了一株新城疫病毒（命名为SHY06）,经蚀斑纯化后测定其鸡胚平均死亡时间和1日龄雏鸡脑内致病指数分别为52h和2.0,F蛋白裂解位点氨基酸序列为112-RRQKRF-117,符合强毒NDV的特征。根据F基因（1374bp）对SHY06和19个NDV参考毒株进行基因分型,结果表明SHY06属于基因Ⅶ型。F基因氨基酸序列同源性比较显示SHY06与基因Ⅶ型NDV分离株同源性为97.5%～99.5%,与基因IX型NDV（F48E9等）同源性为91.7%～92.4%,与基因II型（疫苗株LaSota等）同源性为89.2%。HN基因氨基酸序列同源性比较显示SHY06与近年来分离株同源性较高,为92.1%～99.7%,与疫苗株（LaSota）和标准强毒株（F48E9）同源性较低,分别为87.6%和89.9%。用两株针对新城疫病毒HN基因的单抗1E5和C3-B7检测NDV,均具有血凝抑制性（HI）,免疫球蛋白亚类分别为IgG2a和IgG1。用HiTrap protein-A层析柱对这两株单抗进行了亲和纯化。收集不同洗脱阶段的液体进行蛋白含量测定,结果表明5mL的洗脱液洗脱后,第12mL洗脱液中单抗含量最高。用SDS-PAGE电泳对纯化产物进行纯度鉴定,结果表明单抗纯化后只有重链和轻链两条带。得到纯化的单克隆抗体后,课题组对单克隆抗体1E5进行了模拟抗原表位的筛选。利用噬菌体随机7肽库筛选新城疫病毒（NDV）HN蛋白的B细胞抗原位点。以NDV LaSota株HN蛋白的单克隆抗体（McAb）1E5为靶分子,采用噬菌体随机7肽库进行亲和筛选,经过三轮筛选后得到4组可用的7肽序列。同源性分析表明展示肽序列与HN蛋白的388395位氨基酸具有较高的同源性,竞争ELISA实验证明筛选到的克隆能与病毒产生较为明显的竞争,证明它们的共有序列L * */* PNT是抗原表位的骨架结构。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1 NDV 特性及分子生物学研究
• 2 抗体纯化
• 3 噬菌体肽库技术
• 试验一输卵管积液蛋鸡强毒NDV的分离鉴定与基因分析
• 1. 材料
• 2 方法
• 2.1 病毒的分离、增殖
• 2.2 病毒的鉴定
• 2.3 病毒的蚀斑纯化
• 2.4 纯化病毒的扩增
• 2.5 病毒毒力的测定
• 2.6 F、HN 基因的克隆测序
• 2.7 F、HN 基因的核苷酸序列分析
• 3. 结果
• 3.1 NDV 分离鉴定
• 3.2 NDV 毒力测定结果
• 3.3 NDV F、HN 基因RT-PCR 鉴定及测序
• 3.4 F 基因遗传变异分析
• 3.5 HN 基因遗传变异分析
• 4 讨论
• 试验二 应用 HiTrap protein-A 层析柱纯化新城疫病毒单克隆抗体
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 单克隆抗体的腹水制备
• 2.2 用 HiTrap protein-A 层析柱纯化单抗
• 2.3 纯化后单抗的生物学特性鉴定
• 3 结果
• 3.1 纯化后单抗的HI 和ELISA 效价
• 3.2 标准曲线的制作
• 3.3 单抗纯化洗脱液中HI 效价与蛋白含量
• 3.4 单抗纯化后纯度检测
• 4 讨论
• 试验三 利用噬菌体随机肽库筛选 NDV 单克隆抗体1E5 的模拟抗原表位
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 噬菌体随机肽库的亲和筛选
• 2.2 用ELISA 筛选阳性克隆
• 2.3 噬菌体ssDNA序列测定及分析
• 2.4 NDV 抗原对筛选出的阳性克隆竞争抑制试验
• 2.5 对McAb 1E5 所检测的毒株进行序列分析
• 3 结果
• 3.1 噬菌体的富集
• 3.2 阳性噬菌体克隆的鉴定
• 3.3 阳性噬菌体克隆ssDNA 序列测定及分析
• 3.4 竞争抑制实验
• 3.5 LaSota 病毒株与1E5 检测的变异株和未变异株的比较结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况