双抗体夹心ELISA定量检测IFNβ-HSA融合蛋白分析方法的建立

论文摘要

β干扰素（IFNβ）是干扰素家族中的一员,具有抗病毒、抗增殖和免疫调节作用。雷楗勇等构建了人β干扰素与人血清白蛋白融合蛋白（IFNβ-HSA）,将其在毕赤酵母系统中进行表达。这种融合的方法增大了蛋白药物的分子量,减少了异源蛋白的免疫原性,从而减少肾小球滤过率和体内清除率,有效提高了IFNβ在体内的半衰期,具有广阔的生产和临床应用前景。当前IFNβ-HSA融合蛋白的研究还处在发酵优化提高产量,摸索蛋白纯化工艺提高得率的研究阶段,并且很快将进入药代动力学和临床应用研究中。在这些研究中迫切需要一种能够从介质中区分IFNβ-HSA融合蛋白及其结构类似物、降解片段等,而定量检测IFNβ-HSA融合蛋白原型药物的分析方法。目前蛋白多肽药物的检测分析方法主要有理化分析法、生物检定法和免疫分析法。酶联免疫吸附测定（ELISA）技术是1971年由Engvall和Perlman建立的一种生物活性物质微量测定技术,以其灵敏度高、特异性好等优点,在生命科学各领域得到广泛应用。本课题旨在建立一种双抗体夹心ELISA定量检测IFNβ-HSA融合蛋白原型药物的分析方法。首先从雷楗勇博士构建的IFNβ-HSA融合蛋白表达菌株出发,通过发酵培养、蛋白纯化得到一定纯度的IFNβ-HSA融合蛋白作为抗原标准参考品。经过定量分析,抗原浓度为166μg/mL。选取了两株针对IFNβ-HSA融合蛋白两端多肽的单克隆抗体,建立了双抗体夹心ELISA定量检测方法,可以定量检测IFNβ-HSA融合蛋白原型药物。经过方法学考核。该方法的灵敏度为10 ng/mL,测量范围51.88 ng/mL～3320 ng/mL,不同时间不同批次对1660 ng/mL、415 ng/mL、103.75 ng/mL三个浓度点测定,批内变异系数为4.86±1.05%,批间变异系数8.03±1.08%。与IFNβ、IFNα、HSA、IFNα2b-HSA等IFNβ-HSA融合蛋白结构类似物基本无交叉反应。发酵液上清液中回收率分别为101.2±9.2%、101.9±8.0%、98.7±6.8%。稳定性试验表明有效期在3个月以上。本方法可以应用到发酵优化和分离纯化研究中,用以跟踪测定IFNβ-HSA融合蛋白的诱导表达,测定纯化得率等。并且为后期药代动力学、临床研究提供了新思路和备选方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 IFNβ-HSA 融合蛋白简介
• 1.1.1 IFNβ
• 1.1.2 IFNβ-HSA 融合蛋白
• 1.2 蛋白多肽药物的检测分析方法
• 1.2.1 蛋白质和多肽类药物研究现状及特点
• 1.2.2 蛋白质多肽药物检测分析方法
• 1.2.3 药物浓度检测分析方法评价标准
• 1.3 酶联免疫分析方法
• 1.3.1 基本原理
• 1.3.2 基本类型
• 1.4 课题思路
• 1.5 立题背景及研究内容
• 1.5.1 立题背景和目的
• 1.5.2 研究内容
• 第二章 IFNβ-HSA融合蛋白的制备
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 仪器
• 2.1.4 主要试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 工程菌株的发酵培养与诱导表达
• 2.2.2 IFNβ-HSA 融合蛋白的分离纯化
• 2.2.3 纯化后样品的鉴定和电泳分析
• 2.2.4 纯化后样品中蛋白质定量分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 镍柱纯化分离图谱
• 2.3.2 纯化后蛋白样品鉴定与纯度分析
• 2.3.3 标准参考品中IFNβ-HSA 融合蛋白定量分析
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第三章 IFNβ-HSA融合蛋白双抗体夹心ELISA 检测方法的建立
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要仪器
• 3.1.2 主要材料与试剂
• 3.1.3 缓冲液
• 3.2 方法
• 3.2.1 双抗夹心法ELISA 基本操作步骤
• 3.2.2 显色底物的选择和优化
• 3.2.3 固相载体的选择
• 3.2.4 酶标板条的处理
• 3.2.5 包被抗体和酶标抗体的配对实验
• 3.2.6 包被条件的优化
• 3.2.7 封闭条件的优化
• 3.2.8 洗板条件对测定的影响
• 3.2.9 样品稀释缓冲液的选择
• 3.2.10 包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择
• 3.2.11 双抗夹心ELISA 标准曲线的制作
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 显色底物的选择和优化
• 3.3.2 固相载体的选择
• 3.3.3 酶标板的处理
• 3.3.4 包被抗体和酶标抗体的配对实验
• 3.3.5 包被条件的优化
• 3.3.6 封闭条件的优化
• 3.3.7 洗板条件对测定的影响
• 3.3.8 样品稀释缓冲液的选择
• 3.3.9 包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择
• 3.3.10 标准曲线的绘制
• 3.4 讨论
• 3.4.1 双抗体夹心ELISA 反应模式的选择
• 3.4.2 最适工作浓度的选择
• 3.4.3 反应条件的优化
• 3.4.4 标准曲线的数学模型和拟合方式[45]
• 3.5 本章小结
• 第四章 IFNβ-HSA融合蛋白双抗体夹心ELISA 分析方法的考核
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 主要仪器
• 4.1.2 主要材料与试剂
• 4.1.3 缓冲液
• 4.2 方法
• 4.2.1 灵敏度
• 4.2.2 精密度
• 4.2.3 稳定性
• 4.2.4 特异性
• 4.2.5 回收率
• 4.2.6 健全性分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 灵敏度
• 4.3.2 精密度
• 4.3.3 稳定性
• 4.3.4 特异性
• 4.3.5 回收率
• 4.3.6 健全性分析
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：英文缩略词
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文