人巨噬细胞抑制因子-1（MIC-1）在毕赤酵母中的优化表达、蛋白纯化及多克隆抗体的制备

论文摘要

目的：构建人巨噬细胞抑制因子-1（MIC-1）优化密码子的表达载体，筛选稳定的高表达MIC-1的酵母菌株，探索MIC-1重组蛋白的纯化条件，并制备抗MIC-1多克隆抗体，为胰腺癌血清诊断试剂的研制奠定基础。方法：通过RT-PCR及基因克隆技术自人胎盘组织中获得MIC-1 cDNA的全基因片段；通过PCR技术将MIC-1 cDNA基因片段5’端的7个毕赤酵母非偏好密码子定点突变为其同义优越密码子；构建pPIC9K-mtMIC-1表达载体，转染并在毕赤酵母GS115工程菌中表达MIC-1重组蛋白，通过G418抗性筛选稳定的MIC-1高表达菌株；研究不同表达条件对MIC-1重组蛋白表达量的影响；研究和初步建立MIC-1重组蛋白的纯化方案及工艺；以纯化的重组MIC-1蛋白为抗原免疫新西兰白兔，制备抗MIC-1的多克隆抗体。结果：成功克隆MIC-1 cDNA，并构建优化密码子的MIC-1重组蛋白表达载体；获得稳定的高表达重组蛋白毕赤酵母菌株，表达量约为30～50mg／L；初步建立了MIC-1重组蛋白中试发酵工艺；建立较完整的MIC-1重组蛋白的分离纯化体系，纯化所得重组蛋白经SDS-PAGE电泳检测纯度达90％以上；获得抗MIC-1重组蛋白的多克隆抗血清，抗体效价为1：128，000。结论：通过优化密码子的MIC-1重组蛋白表达载体，重组MIC-1毕赤酵母菌株的表达量显著高于国际上其他单位该蛋白的表达水平；优化了发酵、表达和纯化工艺，重组蛋白纯度达90％以上；以纯化蛋白为抗原获得了高效价的抗MIC-1多克隆抗体。该项研究为MIC-1蛋白的功能研究及其抗体的临床诊断试剂研制奠定了基础。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 实验流程
• 第一部分:人巨噬细胞抑制因子-1（MIC-1）表达质粒的构建及其在毕赤酵母中的优化表达
• 材料与方法
• 一、实验材料
• 二、主要试剂
• 三、主要仪器
• 四、实验方法
• 1、MIC-1重组蛋白表达载体的构建
• 1.1、提取人胎盘组织总RNA
• 1.2、RT-PCR法获得wtMIC-1 cDNA基因片断
• 1.3、wtMIC-1 cDNA PCR产物的序列测定
• 1.4、PCR法获得mtMIC-1 cDNA基因片断
• 1.5、pPIC9和pPIC9K质粒的小量制备
• 1.6、pPIC9质粒和mtMIC-1基因的酶切与回收
• 1.7、mtMIC-1基因酶切片段和pPIC9质粒酶切片段的连接
• 1.8、感受态大肠杆菌的制备（氯化钙法）
• 1.9、pPIC9-mtMIC-1连接产物转化大肠杆菌DH5α
• 1.10、重组pPIC9-mtMIC-1质粒酶切鉴定
• 1.11、重组pPIC9-mtMIC-1质粒的序列测定
• 1.12、重组pPIC9-mtMIC-1质粒和pPIC9K质粒酶切与回收
• 1.13、重组pPIC9-mtMIC-1质粒双酶切mtMIC-1基因片段和pPIC9K质粒酶切片段的连接
• 1.14、pPIC9K-mtMIC-1连接产物转化大肠杆菌DH5α
• 1.15、重组pPIC9K-mtMIC-1质粒酶切鉴定
• 1.16、重组pPIC9K-mtMIC-1质粒的序列测定
• 2、重组pPIC9K-mtMIC-1质粒转染GS115工程菌并诱导表达
• 2.1、重组pPIC9K-mtMIC-1质粒转染感受态GS115菌株
• 2.2、G418抗性筛选多拷贝的重组克隆
• 2.3、重组GS115菌株中的诱导表达
• 3、重组pPIC9K-mtMIC-1毕赤酵母菌株的筛选和鉴定
• 3.1、SDS-PAGE电泳样品的还原及非还原处理
• 3.2、SDS-PAGE电泳检测表达产物及凝胶的染色
• 3.3、Western blotting检测蛋白表达
• 3.4、重组菌株表达条件的优化
• 3.5、MIC-1重组GS115菌株的发酵及发酵条件的初步优化
• 结果
• 一、MIC-1重组蛋白表达载体的构建
• 1、提取人胎盘组织总RNA
• 2、wt MIC-1和mtMIC-1 cDNA的PCR扩增结果
• 3、重组pPIC9-mtMIC-1质粒和pPIC9K-mtMIC-1质粒的酶切鉴定
• 4、重组pPIC9-mtMIC-1质粒的测序鉴定
• 二、重组GS115稳定表达菌株的筛选和鉴定
• 1、重组GS115菌株表达产物的SDS-PAGE电泳鉴定
• 2、重组GS115菌株表达产物的Western blotting鉴定
• 3、重组菌株MIC-1表达条件的优化
• 3.1、不同甲醇浓度对MIC-1表达的影响
• 3.2、不同诱导时间对MIC-1表达的影响
• 讨论
• 第二部分:MIC-1重组蛋白的初步纯化工艺研究
• 材料与方法
• 一、主要试剂
• 二、主要仪器
• 三、实验方法
• 1、样品的处理及硫酸铵沉淀
• 2、G25凝胶过滤层析脱盐
• 3、Source 30Q阴离子交换层析连续梯度洗脱
• 4、Source 30Q阴离子交换层析阶梯梯度洗脱
• 5、G25凝胶过滤层析脱盐
• 6、冻干
• 7、MIC-1重组蛋白的定量
• 7.1、使用PIERCE BCA蛋白定量法（试剂盒）
• 7.2、使用ELISA双抗体夹心法定量（试剂盒）
• 8、SDS-PAGE电泳检测MIC-1重组蛋白的纯度
• 结果
• 1、硫酸铵沉淀
• 2、G25凝胶过滤层析脱盐
• 3、Source 30Q阴离子交换层析连续梯度洗脱
• 4、Source 30Q阴离子交换层析阶梯梯度洗脱
• 5、冻干
• 6、MIC-1重组蛋白的定量
• 7、SDS-PAGE电泳检测重组MIC-1纯度
• 讨论
• 第三部分:抗MIC-1蛋白多克隆抗体的制备
• 材料与方法
• 一、主要试剂
• 二、仪器及器材
• 三、实验动物
• 四、实验方法
• 1、动物及抗原的准备
• 2、免疫动物
• 3、血清抗体效价的检测
• 3.1、双向琼脂扩散法
• 3.2、ELISA法
• 4、免疫动物抗血清的采集与保存
• 5、抗血清特异性的评价（Western blotting法）
• 结果
• 1、血清抗体效价的检测
• 2、抗血清特异性的评价
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢