乳腺癌转移相关基因筛选及功能研究

论文摘要

目的:筛选新的乳腺癌转移相关基因并进行功能研究,为乳腺癌诊断提供分子标志,为乳腺癌治疗提供靶点,为阐明乳腺癌发生和转移机制提供线索。方法:利用mRNA差异显示技术筛选乳腺原发癌与配对淋巴结转移癌组织的差异表达基因片段;利用同位素标记的反向斑点杂交和荧光标记的基因芯片杂交方法验证候选差异基因。采用实时定量逆转录-聚合酶链反应方法（qRT-PCR）检测乳腺癌原发癌组织及癌旁正常组织中kinesin-like 4（KNSL4）基因mRNA表达,统计学分析与乳腺癌发生、临床病理因素和患者预后的关系;采用免疫组织化学方法检测乳腺癌组织中KNSL4基因编码的驱动蛋白样DNA结合蛋白Kid的表达,分析Kid的组织细胞定位及与细胞侵袭和转移的关系。克隆KNSL4 siRNA真核表达质粒载体pSilencerTM3.1-KNSL4 siRNA,转染高表达Kid的人乳腺癌细胞系MDA-MB-435S,并建立稳定沉默KNSL4表达的亚克隆细胞,以观察KNSL4及其编码蛋白Kid对细胞体内外生物学行为的影响。采用染色质免疫沉淀联合启动子芯片（ChIP-on-chip）方法筛选Kid下游调控基因,ChIP-qPCR方法验证筛选基因与Kid的结合,qRT-PCR方法分析下调乳腺癌细胞Kid表达对候选基因的转录调节作用。结果:筛选得到4个未知的基因序列（Expressed Sequence Tag,EST）登录在GenBank,序列号为BG518428、BG518429、BM005520、BM005521;验证证实KNSL4基因在乳腺转移癌中表达下调。KNSL4 mRNA在癌组织中表达,而在正常组织中不表达（P=0.000）;KNSL4 mRNA低水平患者5年无病生存期低于高水平患者（P=0.016）,KNSL4 mRNA水平是临床III期和Her2阳性乳腺癌患者预后预测分子标志物（P=0.023,P=0.041）。Kid蛋白在增殖的肿瘤细胞中高表达,而在侵袭和迁移的细胞中表达下调。KNSL4基因转录沉默的亚克隆细胞增殖能力降低,细胞周期G2期比率增加,细胞有丝分裂阻滞,而细胞的克隆形成率没有影响,体内和体外的侵袭和迁移能力也没有改变。CDC25C和ATF7IP是Kid作为转录因子的下游调节基因,且Kid对二者起负调控作用。结论:KNSL4基因及其编码蛋白Kid是乳腺癌细胞转移状态的指示者,而非转移生物学过程的调控者。Kid在细胞有丝分裂中起关键作用,与CDC25C形成的负反馈调节环异常可以使细胞有丝分裂异常,进而使细胞恶性转化和恶性增殖。KNSL4基因表达是潜在的乳腺癌预后预测分子标志物和抗肿瘤治疗的分子靶标。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 采用m RNA差异显示技术筛选乳腺癌转移相关基因
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 病例选择及标本取材
• 1.1.2 m RNA DD筛选乳腺原发癌与淋巴结转移癌的差异表达基因
• 1.1.3 同位素标记的反向斑点杂交验证筛选基因
• 1.1.4 荧光标记的基因芯片杂交验证筛选基因
• 1.2 结果
• 1.2.1 RNA质量鉴定
• 1.2.2 m RNA DD筛选乳腺原发癌与配对淋巴结转移癌差异表达基因
• 1.2.3 同位素标记的反向斑点杂交
• 1.2.4 荧光标记的基因芯片比较杂交
• 1.3 讨论
• 第二章 KNSL4 表达与乳腺癌发生和转移的关系及其临床价值
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 病例资料及标本取材
• 2.1.2 实时定量 RT-PCR方法检测乳腺癌组织中KNSL4 mRNA表达
• 2.1.3 免疫组织化学检测乳腺癌组织中Kid蛋白表达
• 2.1.4 统计学分析
• 2.2 结果
• 2.2.1 乳腺原发癌与癌旁正常组织中KNSL4 mRNA表达的比较
• 2.2.2 乳腺原发癌组织KNSL4 mRNA表达与临床因素及预后的关系
• 2.2.3 乳腺癌组织中Kid蛋白的细胞定位及组织分布
• 2.3 讨论
• 第三章 KNSL4 转录沉默对乳腺癌细胞生物学行为的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 细胞系及实验动物
• 3.1.2 KNSL4 siRNA稳定表达乳腺癌细胞亚克隆株的筛选
• 3.1.3 KNSL4 基因沉默对乳腺癌细胞体外生物学行为的影响
• 3.1.4 KNSL4 基因沉默对乳腺癌细胞体内生物学行为的影响
• 3.2 结果
• 3.2.1 Kid在不同生物学行为乳腺癌细胞系的表达
• 3.2.2 KNSL4 siRNA表达载体的转染效率和稳定细胞克隆筛选
• 3.2.3 MDA-MB-435S/KNSL4 siRNA亚克隆细胞的体外生物学行为
• 3.2.4 MDA-MB-435S/KNSL4 siRNA亚克隆细胞的体外生物学行为
• 3.3 讨论
• 第四章 采用ChIP-on-chip方法筛选Kid下游调控基因
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 细胞系及培养
• 4.1.2 染色质免疫沉淀
• 4.1.3 启动子基因芯片杂交
• 4.1.4 候选基因的ChIP-DNA实时定量PCR验证
• 4.1.5 实时定量RT-PCR比较下调乳腺癌细胞Kid表达对其转录调节候选基因表达的影响
• 4.2 结果
• 4.2.1 超声裂解染色质DNA片段长度检测
• 4.2.2 ChIP-DNA固相选择与连接的结果
• 4.2.3 启动子芯片扫描与数据分析结果
• 4.2.4 差异基因的筛选结果
• 4.2.5 ChIP-qPCR检测ATF71P、CDC25C、TM45F3 及PIP结果
• 4.2.6 ATF7IP、CDC25C、PIP及TM4SF3 基因在的MDA-MB-435S/KNSL4 siRNA 和MCF-7/KNSL4 siRNA细胞中表达量的改变
• 4.3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 致谢