高效广谱苏云金芽孢杆菌工程菌的构建及杀虫晶体蛋白的研究

论文题目: 高效广谱苏云金芽孢杆菌工程菌的构建及杀虫晶体蛋白的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 王广君

导师: 黄大昉,张杰

关键词: 苏云金芽孢杆菌工程菌,杀虫晶体蛋白,营养期杀虫蛋白,蛋白结晶,嵌合蛋白

文献来源: 中国农业科学院

发表年度: 2005

论文摘要: 苏云金芽孢杆菌（Bt）是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物,但是传统的Bt菌株存在杀虫谱窄、毒力低等缺点,因此必须通过生物技术手段构建高效广谱的Bt工程菌来满足生产的需要。苏云金芽孢杆菌的杀虫活性主要来源于其在芽孢形成过程中产生的杀虫晶体蛋白,杀虫晶体蛋白结构和作用机制是目前国内外研究的一个热点;在了解杀虫晶体蛋白结构与功能关系的基础上,可以通过分子设计来改变杀虫晶体蛋白的毒力和杀虫谱,为转基因植物或微生物提供新的基因来源。 本论文围绕苏云金芽孢杆菌工程菌的构建、杀虫晶体蛋白的分子设计、杀虫晶体蛋白的体外结晶等方面进行了一系列的研究,主要内容包括: 将对鞘翅目害虫高毒力的cry3Aα7基因分别通过电击转化到对鳞翅目害虫高毒力的野生菌株G03和UV17中,得到工程菌G033A和UV173A。室内生测结果表明两株工程菌对鞘翅目害虫和鳞翅目害虫都表现出很高的毒力,其中G033A对鞘翅目害虫榆蓝叶甲和马铃薯甲虫的LC50分别为3.10 mg/ml、0.40 mg/ml,对鳞翅目害虫甜菜夜蛾和小菜蛾的LC50分别为40.30 μg/ml、8.13μg/ml;UV173A对榆蓝叶甲和马铃薯甲虫的LC50分别为1.47 mg/ml、0.31 mg/ml,对小菜蛾的LC50为18.03 μg/ml。工程菌在田间对鞘翅目害虫和鳞翅目害虫也表现出了很好的防效。在用量为40 g/亩时,G033A对甜菜夜蛾的防效达67.9%;在使用浓度为1g/L时,G033A对马铃薯甲虫的防治效果为89.2%,UV173A为94.6%;接近化学农药的防治水平,具有良好的开发和应用前景。 通过监测工程菌在田间的残留、扩散以及对非靶标昆虫的影响,完成了工程菌中间试验和环境释放阶段的安全性评价。评价结果表明工程菌G033A和UV173A在田间存活时间较短,扩散范围较小,对草蛉、瓢虫等非靶标昆虫种群无不良影响。因此认为这两种工程菌使用安全,对于生态环境不会造成有害影响。 为了确定Cry1Ba3的最小活性区,通过PCR扩增获得9种不同长度的cry1Ba3基因片段,分别在大肠杆菌BL21中表达。采用浸叶法测定了相应蛋白片段对小菜蛾的杀虫活性,最终将Cry1Ba3蛋白对小菜蛾的最小活性区确定在第22-655位氨基酸之间。 通过重叠引物PCR得到由Cry1Ca蛋白Domain Ⅰ分别与Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac Domain Ⅲ组合的嵌合基因cry1C1C1Aa、cry1C1C1Ab、cry1C1C1Ac,在大肠杆菌BL21中进行表达;提取三种蛋白,对棉铃虫和甜菜夜蛾进行了杀虫毒力测定。结果表明,与Cry1Ca蛋白相比,三种嵌合蛋白对对棉铃虫的毒力力有不同程度的提高,但对甜菜夜蛾的毒力都有所降低。 通过高效液相色谱纯化了对小菜蛾高毒力的Cry1Ba3-3H蛋白以及对甜菜夜蛾高毒力的营养期杀虫蛋白Vip3A。采用气相扩散法,探索了两种蛋白体外结晶的条件,最终分别得到了方形的Cry1Ba3-3H蛋白晶体和正八面体形的Vip3A蛋白晶体。这些结果将为这两种蛋白的结构与功能解析奠定了基础。

论文目录:

绪论

1 苏云金芽孢杆菌

1.1 杀虫毒素

1.2 杀虫蛋白与其它物质间的增效

2 杀虫蛋白的应用

2.1 转Bt杀虫基因植物

2.2 转基因微生物

3 转基因生物的安全性

4 本研究的立题依据

5 本研究的目的和意义

第一章 对鳞翅目和鞘翅目害虫高毒力工程菌的构建

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 研究方法

2 结果与分析

2.1 载体pSTK的构建

2.2 重组质粒pSTK-3A的构建

2.3 工程菌G033A和UV173A的构建和验证

2.4 工程菌G033A和UV173A的生长特性

2.5 工程菌的遗传稳定性

2.6 工程菌的发酵

2.7 工程菌的生物活性测定

3 讨论

4 小结

第二章 工程菌G033A和UV173A的生物安全性评价

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 研究方法

2 结果与分析

2.1 工程菌的残留分析

2.2 工程菌的扩散分析

2.3 工程菌对其它非靶标昆虫的影响

3 讨论

4 小结

第三章 杀虫晶体蛋白Cry1Ba3最小活性区的测定

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 研究方法

2 结果和分析

2.1 序列分析结果

2.2 引物设计

2.3 不同cry1Ba3基因片段的克隆和检测

2.4 不同cry1Ba3基因片段的表达

2.5 不同Cry1Ba3蛋白片段的生物活性测定

3 讨论

4 小结

第四章 杀虫晶体蛋白Cry1Ba3活性区的体外结晶

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 研究方法

2 结果与分析

2.1 含cry1Ba3-3H基因片段的重组质粒的构建

2.2 Cry1Ba3-3H蛋白的诱导表达

2.3 Cry1Ba3-3H蛋白对小菜蛾的生物活性

2.4 Cry1Ba3-3H蛋白的分离纯化

2.5 Cry1Ba3-3H蛋白结晶

3 讨论

4 小结

第五章 营养期杀虫蛋白Vip3A的纯化与体外结晶

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 研究方法

2 结果与分析

2.1 Bt C008中vip3A基因的扩增和克隆

2.2 vip3A基因的序列分析

2.3 vip3A基因的诱导表达

2.4 Vip3A蛋白对甜菜夜蛾的生物活性测定

2.5 蛋白的分离纯化

2.6 蛋白结晶

3 讨论

4 小结

第六章 杀虫晶体蛋白的分子设计

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 研究方法

2 结果与分析

2.1 不同杀虫晶体蛋白的序列分析

2.2 引物设计

2.3 嵌合基因的构建

2.4 重组表达质粒的构建和检测

2.5 嵌合蛋白的诱导表达和SDS-PAGE检测

2.6 生物活性测定

3 讨论

4 小结

第七章 结论

参考文献

致谢

作者简历

发布时间: 2005-09-05

参考文献

• [1].苏云金杆菌4.0718菌株的cry杀虫基因和功能蛋白质组学研究[D]. 丁学知.湖南农业大学2006
• [2].苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ca7分子设计[D]. 任羽.中国农业科学院2008
• [3].双价转基因抗虫棉的获得及其抗虫性与生理生化特征[D]. 李付广.中国农业科学院2003
• [4].苏云金芽胞杆菌帮助蛋白对杀虫晶体蛋白表达的影响[D]. 邵宗泽.华中农业大学2000
• [5].苏云金芽胞杆菌MC28基因组完成图及其杀虫功能基因研究[D]. 关鹏.四川农业大学2013
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• [7].苏云金芽胞杆菌Cry51Aa1杀虫晶体蛋白结构及功能研究[D]. 徐承晨.华中农业大学2015
• [8].苏云金芽胞杆菌YBT-1520热胁迫下的生理变化及差异蛋白质组研究[D]. 吴丹丹.华中农业大学2011

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