论文题目: BLyS134-285对噬菌体展示文库的筛选及其受体突变体的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 微生物与生化药学
作者: 丁艳丽
导师: 杨胜利,龚毅
关键词: 噬菌体展示系统,短肽
文献来源: 沈阳药科大学
发表年度: 2005
论文摘要: B淋巴细胞刺激因子（BLyS）是1999年发现的肿瘤坏死因子（TNF）家族的一个新成员，主要调节B细胞的增殖、分化，BLyS表达异常会引起严重的免疫功能紊乱。本研究首先在大肠杆菌中对BLyS134-285进行了可溶表达，获得了有活性的表达产物，以BLyS134-285为靶蛋白对噬菌体随机12肽库进行亲和淘洗，筛选到一结合肽；其次将该肽与BLyS受体—B细胞成熟抗原（BCMA）胞外区序列比较，确定位点对BCMA进行了定点突变，并找到BCMA与BLyS134-285结合的关键氨基酸；同时，我们用BLyS134-285和FP248两种蛋白分别对噬菌体展示scFv文库进行淘洗，在获得各自高亲和力克隆的基础上，成功地将抗体噬菌体作为一抗在Western blot中应用，为Western blot中一抗的获得提供了一种新的途径。研究工作分为以下三个部分： （1）在大肠杆菌BL21（DE3）中以低温诱导获得了BLyS134-285的可溶性表达，经过Ni-NTA树脂纯化表达产物，纯度达到80％左右；分离小鼠脾脏B细胞，用MTT法测定BLyS134-285对其的增殖情况，证实了BLyS134-285的活性。以BLyS134-285为靶蛋白对噬茵体展示随机12肽库进行了筛选。经过3轮淘洗，噬菌体产出与投入的比值逐轮升高，表明与BLyS134-285特异性结合的噬菌体得到了富集。在洗脱时我们采用了酸洗脱与受体竞争洗脱相结合的形式，最后从第3轮高浓度受体洗脱下的噬菌体中，随机挑选20个克隆用ELISA测定结合活性，并将强阳性信号的克隆送出测序，多个克隆在测序后得到了同一个小肽序列（T1）。将T1与GST融合，在大肠杆菌获得高表达，目的蛋白表达量占菌体总蛋白50％，用Glutathione-agarose纯化后纯度高达95％。ELISA实验进一步确证了融合表达的
论文目录:
中文摘要
ABSTRACT
英文缩写说明
第一章 绪论
第一节 BLyS研究进展
1. BLyS的结构、表达调控及受体
1.1 结构
1.2 表达调控
1.3 受体
2. BLyS的生物学功能
2.1 对 B淋巴细胞的作用
2.2 对 T淋巴细胞的作用
3. 信号通路
4. BLyS与疾病的关系
4.1 BLyS与自身免疫病
4.2 BLyS与癌症
4.3 BLyS与感染
5. 治疗策略
第二节 噬菌体展示技术的研究进展
1. 噬菌体展示技术的基本原理
2. 筛选技术
3. 噬菌体展示系统
3.1 丝状噬菌体展示系统
3.2 λ噬菌体展示系统
3.3 T4噬菌体展示系统
3.4 T7噬菌体展示系统
4. 噬菌体展示系统应用
4.1 抗原表位分析
4.2 蛋白质之间相互作用位点分析
4.3 研制人源性抗体
4.4 药物设计和疫苗开发
5. 前景与展望
第二章 BLyS_(134-285)对噬菌体随机12肽库的筛选
2.1 实验材料
2.1.1 菌株、质粒、文库和实验动物
2.1.2 抗体
2.1.3 工具酶及主要试剂
2.1.4 培养基及溶液配制
2.1.5 主要仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 质粒 DNA小量快速抽提
2.2.2 质粒 DNA的酶切与连接
2.2.3 大肠杆菌的转化
2.2.3.1 感受态细胞的制备
2.2.3.2 质粒 DNA及连接产物的转化
2.2.4 DNA片段的回收
2.2.5 重组子在大肠杆菌的表达
2.2.6 Ni-NTA树脂亲和纯化蛋白质
2.2.7 蛋白质浓度测定
2.2.8 小鼠脾脏 B淋巴细胞分离及 MTT检测
2.2.8.1 尼龙棉柱的制备
2.2.8.2 分离小鼠脾脏 B细胞
2.2.8.3 MTT检测
2.2.9 对噬菌体随机12肽库的筛选
2.2.9.1 淘洗
2.2.9.2 噬菌体的滴度测定
2.2.9.3 噬菌体的扩增和纯化
2.2.10 ELISA鉴定噬菌体克隆的结合活性
2.2.11 噬菌体克隆的竞争 ELISA
2.2.12 GST融合蛋白的纯化
2.3 实验结果
2.3.1 BLyS_(134-285)的表达与纯化
2.3.1.1 BLyS_(134-285)的表达
2.3.1.2 BLyS_(134-285)的纯化
2.3.2 MTT测定 BLyS_(134-285)活性
2.3.3 BLyS_(134-285)对噬菌体12肽库的筛选
2.3.3.1 淘洗
2.3.3.2 Phage-ELISA
2.3.3.3 噬菌体克隆的 DNA测序及展示肽段的序列分析
2.3.3.4 噬菌体克隆的竞争 ELISA
2.3.4 GST-T1重组质粒的构建
2.3.5 GST融合小肽在大肠杆菌中的表达与纯化
2.3.5.1 GST融合小肽的表达
2.3.5.2 GST融合小肽的纯化
2.3.6 ELISA检测 GST-T1与BLyS_(134-285)的结合
2.4 讨论
第三章 BCMA突变体的研究
3.1 实验材料
3.1.1 质粒、抗体
3.1.2 溶液
3.2 实验方法
3.2.1 质粒提取、酶切、连接、转化以及重组子在大肠杆菌的表达
3.2.2 Fc融合蛋白的纯化
3.2.3 Over-lap PCR介导定点突变
3.2.4 Western blot
3.2.5 ELISA比较各突变体与BLyS_(134-285)的结合活性
3.3 实验结果
3.3.1 突变位点的确立
3.3.2 引物设计
3.3.3 pT7Fc1-mBCMA的构建
3.3.3.1 mBCMA的 DNA扩增
3.3.3.2 pT7Fc1-mBCMA的构建
3.3.4 mBCMA在大肠杆菌的可溶表达与纯化
3.3.4.1 mBCMA的可溶表达
3.3.4.2 mBCMA的纯化
3.3.5 mBCMA与BLyS_(134-285)结合活性的比较
3.4 讨论
第四章 噬菌体展示单链抗体在Western blot中的应用
4.1 实验材料
4.2 实验方法
4.2.1 辅助噬菌体 VCSM13的扩增
4.2.2 对scFv噬菌体库的淘洗
4.2.3 噬菌体滴度测试
4.2.4 噬菌体扩增与纯化
4.2.5 ELISA鉴定噬菌体克隆的结合活性
4.2.6 ELISA测定噬菌体克隆亲和力
4.2.7 噬菌体-Western blot
4.3 实验结果
4.3.1 噬菌体展示scFv文库的淘洗
4.3.2 噬菌体克隆的鉴定
4.3.3 B16与 BLyS_(134-285)及 F1与 FP248结合力比较
4.3.4 噬菌体-Western blot
4.4 讨论
结论
参考文献
致谢
发表文章
发布时间: 2006-11-27
参考文献
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