蒙古冰草组织培养再生体系建立及其DREB基因功能研究

论文摘要

蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）具有耐寒、耐旱等优异特性,是其他近缘植物抗性改良资源利用的基因库。本研究以蒙古冰草营养体为外植体建立了高效的蒙古冰草再生体系,并对蒙古冰草DREB基因的功能进行了验证。结果如下：1.蒙古冰草再生体系建立蒙古冰草营养体愈伤组织诱导以茎尖为宜,适宜的愈伤组织诱导培养基为MS+2,4-D1.5mg/L+6-BA0.1mg/L,诱导率达到84.9%。适宜的分化培养基为MS+6-BA2.Omg/L+NAA0.5mg/L,分化率53.2%。生根培养基MS+NAA0.5mg/L,生根率100%。2.蒙古冰草DREB基因遗传转化蒙古冰草DREB基因正确插入了载体pCAMBIA2300-35S-OCS的启动子与终止子之间,成功构建了蒙古冰草DREB的植物表达载体PCAMBIA2300-MDREB。构建的表达载体质粒转化根癌农杆菌LB4404中,侵染烟草叶盘,首次获得30株转基因再生植株,经PCR、PCR-Southern及RT-PCR鉴定,15株为阳性,7株出现了杂交谱带,6株在转录水平稳定表达。证明蒙古冰草DREB基因已整合到烟草基因组中,并在转录水平上表达。3.转基因烟草抗性功能分析1)干旱胁迫下转基因烟草叶片的萎蔫程度明显低于野生型烟草,恢复浇水后,转基因烟草叶片的膨压恢复也较野生型烟草好。2)干旱胁迫下转基因烟草的细胞膜相对电导率低于野生型烟草,超氧化物歧化酶活性及游离脯氨酸含量均高于野生型烟草。3)转基因植株出现矮化现象。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 蒙古冰草概述
• 1.1.1 植物学以及生物学特性
• 1.1.2 蒙古冰草研究进展
• 1.2 转录因子概述
• 1.2.1 DREB类转录因子的结构
• 1.2.2 DREB类转录因子的研究现状
• 1.2.3 DREB转录因子与植物抗逆性的关系
• 1.3 植物遗传转化概述
• 1.3.1 根癌农杆菌介导法
• 1.3.2 根癌农杆菌介导法在植物遗传转化中的应用
• 1.3.3 植物遗传转化研究
• 1.4 研究目的与意义
• 2 蒙古冰草再生体系建立
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 无菌苗培养
• 2.2.2 外植体选择
• 2.2.3 培养条件
• 2.2.4 数据处理
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 茎尖、茎段对蒙古冰草愈伤诱导的影响
• 2.3.2 不同激素浓度对蒙古冰草茎尖愈伤诱导的影响
• 2.3.3 愈伤组织的分化
• 2.3.4 再生植株的生根与移栽
• 2.4 小结与讨论
• 3 蒙古冰草DREB基因的分离及植物表达载体构建
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 载体
• 3.1.3 主要试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 蒙古冰草总RNA提取
• 3.2.3 蒙古冰草DREB基因cDNA合成以及PCR扩增
• 3.2.4 目的片段的分离及测序
• 3.2.5 DREB植物表达载体构建
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 蒙古冰草总RNA提取鉴定
• 3.3.2 蒙古冰草DREB基因分离
• 3.3.3 蒙古冰草DREB基因表达载体构建
• 3.4 小结与讨论
• 4 蒙古冰草DREB基因遗传转化烟草
• 4.1 材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 菌株
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 培养基
• 4.2 方法
• 4.2.1 蒙古冰草DREB表达载体导入农杆菌
• 4.2.2 农杆菌介导法烟草遗传转化
• 4.2.3 转基因烟草植株的检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 植物表达载体质粒转化农杆菌质粒PCR鉴定
• 4.3.2 烟草的遗传转化
• 4.3.3 转基因烟草植株的鉴定
• 4.4 小结与讨论
• 5 转基因烟草的抗性分析
• 5.1 材料
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 主要试剂
• 5.2 方法
• 5.2.1 细胞膜透性测定
• 5.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
• 5.2.3 游离脯氨酸含量的测定（茚三酮法）
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 干旱胁迫下转基因烟草叶片的形态观察
• 5.3.2 转基因烟草生理生化指标测定
• 5.3.3 转基因烟草植株矮化观察
• 5.4 小结与讨论
• 6 结论
• 6.1 蒙古冰草再生体系建立
• 6.2 蒙古冰草DREB基因遗传转化
• 6.3 转基因烟草抗性分析
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介