补肾益气方调控人早孕滋养细胞SOCS3表达改善其生物学功能的研究

论文摘要

反复自然流产是最常见的妊娠并发症，严重危害妇女的生殖健康，母胎界面免疫内分泌调节异常是其重要原因。我们系列临床研究和动物实验表明，补肾益气方促进滋养细胞增殖及其分化，提高孕鼠蜕膜IL-10／IFN-γ比值及血中孕酮、PRL水平，整体调节生殖免疫内分泌网络平衡，但是具体调控机制不明。细胞因子信号转导抑制子（suppressors of cytokine signaling，SOCS）蛋白是近年发现的细胞因子的负调控因子，调控众多细胞因子和激素的信号转导，参与调控免疫应答及内分泌功能。此外SOCS3调控细胞增殖信号通路的作用也开始被认识，动物实验表明SOCS3是调控滋养细胞发育、分化的重要因素：胎龄9.5天小鼠滋养细胞表达SOCS3，若SOCS3缺失则小鼠滋养细胞受损，孕13天内胎鼠全部死亡，但是人早孕母胎界面的SOCS表达尚无报道。在了解人正常早孕母胎界面SOCS表达基础上，研究补肾益气方调控人早孕滋养细胞SOCS3表达及对细胞生长、分泌、细胞问相互对话等生物学功能的作用，为进一步探索母胎界面免疫内分泌网络调节机制及中药新的药效机理奠定基础。本研究主要包括三部分实验内容：第一部分人正常早孕母胎界面SOCS1、SOCS2、SOCS3表达及其调控目的了解人正常早孕绒毛组织、蜕膜组织SOCS1、SOCS2、SOCS3表达特征，研究体外培养细胞滋养细胞和蜕膜基质细胞SOCS1、SOCS2、SOCS3基础表达，初步探讨调控人早孕母胎界面SOCS表达的可能因素。方法应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot法检测SOCS1、SOCS2、SOCS3基因及蛋白表达；冰冻切片免疫组化定位检测母胎界面SOCS蛋白；胰蛋白酶／DNaseⅠ分步消化，硅化聚乙酰胺吡咯烷酮（Percoll）密度梯度离心法，分离纯化人正常早孕细胞滋养细胞、蜕膜基质细胞，经抗Cytokeratin7、Vimentin单克隆抗体免疫细胞化学鉴定其纯度；ELISA法检测细胞滋养细胞、蜕膜基质细胞IL-10、IFN-γ分泌。结果（1）RT-PCR结果显示：人正常早孕绒毛组织、蜕膜组织见SOCS1、SOCS2、SOCS3基因表达，其中SOCS3表达较为普遍，绒毛／蜕膜阳性率73.7％／71.1％；SOCS2次之，绒毛／蜕膜阳性率50.0％／39.5％；SOCS1表达最少，绒毛／蜕膜阳性率34.2％／31.6％，绒毛组织及蜕膜组织SOCS1、SOCS2、SOCS3基因多为中、低表达，SOCS蛋白表达特征与转录水平基本一致。SOCS1、SOCS2、SOCS3蛋白分布于绒毛滋养细胞全层，散在分布于蜕膜间质；滋养细胞和蜕膜细胞表达的SOCS蛋白既可以分布在细胞浆内，也可以分布在细胞核内，或者兼而有之。（2）体外分离人早孕细胞滋养细胞和蜕膜基质细胞，予1％胎牛血清的DMEM-F12培养14h，两种细胞均表达SOCS2、SOCS3基因；同时细胞滋养细胞、蜕膜基质细胞分泌的IL-10，高于同种细胞培养2h时的分泌水平（P＜0.05），IFN-γ分泌无明显变化（P＞0.05）。（3）IL-10（0.1ng／ml）可上调细胞滋养细胞、蜕膜基质细胞SOCS2、SOCS3基因表达。结论正常母胎界面表达SOCS1、SOCS2、SOCS3，细胞滋养细胞和蜕膜基质细胞自分泌和旁分泌IL-10可能是母胎界面表达SOCS2、SOCS3的诱因之一，SOCS可能参与母胎界面免疫内分泌网络的调节，进一步研究SOCS的生物学功能将为了解复杂的妊娠机制提供有价值的信息。第二部分补肾益气方促进人细胞滋养细胞SOCS3表达及其生长目的检测补肾益气方对原代培养人早孕细胞滋养细胞及人滋养细胞肿瘤JAR细胞株SOCS3表达的调控，探讨中药促进细胞滋养细胞生长的作用机制。方法采用Percoll密度梯度离心法，分离纯化人正常早孕细胞滋养细胞，免疫细胞化学鉴定其纯度；RT-PCR法检测细胞滋养细胞SOCS3基因表达；Western blot检测细胞滋养细胞SOCS3蛋白表达、STAT3活化及ERK磷酸化的变化；MTT法检测人细胞滋养细胞、JAR细胞株增殖活力；PCNA-PE单标志流式细胞术分析细胞增殖情况、Annexin V-FITC／PI双标记流式细胞术分析细胞早期凋亡；用SOCS3特异性的siRNA转染JAR细胞，realtime PCR等法验证转染效果，检测转染后细胞ERK1／2的活化及STAT3的磷酸化；用SOCS3正义基因转染JAR细胞，促进SOCS3表达，PCNA-PE单标志流式细胞术分析细胞增殖变化。结果（1）10％和20％补肾益气方含药血清呈浓度依赖性增强人正常早孕细胞滋养细胞增殖活力及PCNA表达：中药对JAR细胞株有类似作用。1％胎牛血清培养细胞滋养细胞48h，Annexin V-FITC+PI-细胞为38.19±7.45％，加入10％和20％中药处理后，滋养细胞凋亡显著减少，分别为14.61±0.66％、5.79±1.74％，其抑制作用呈剂量依赖关系，其中20％含药血清作用最强。（2）10％和20％补肾益气方含药血清上调人细胞滋养细胞SOCS3表达的作用相似：中药处理1h，细胞SOCS3表达己增加，2h达到峰值，随后下降，中药作用4h细胞SOCS3表达接近或达到基础水平；20％含药血清上调的SOCS3表达强度高于10％含药血清组。（3）补肾益气方含药血清以浓度依赖性方式促进人细胞滋养细胞ERK1／2磷酸化，但是未见中药诱导的STAT3活化；10％含药血清作用10min即可促进JAR细胞ERK1／2磷酸化和SOCS3表达，该效应至少维持8h。（4）MEK激酶抑制剂U0126抑制中药诱导的人细胞滋养细胞ERK1／2磷酸化及SOCS3表达同时，抑制中药诱导的细胞滋养细胞增殖活力及PCNA表达，一定程度上抑制中药的抗滋养细胞早期凋亡作用。（5）mTOR抑制剂雷帕霉素也可抑制中药诱导的人细胞滋养细胞SOCS3表达，抑制细胞增殖活力及PCNA表达，但是不影响中药诱导的ERK磷酸化。（6）SOCS3 StealthTMsiRNA转染JAR细胞48h后，予10％补肾益气方含药血清作用1h、2h、4h、8h，可见JAR细胞ERK1／2磷酸化，未见SOCS3蛋白的表达及STAT3磷酸化。（7）SOCS3正义基因转染JAR细胞使SOCS3过表达，无血清培养48h转染组细胞PCNA阳性率高于未转染组。结论补肾益气方含药血清呈浓度依赖性促进人细胞滋养细胞增殖，抑制细胞早期凋亡；补肾益气方作用4h内，可迅速上调细胞滋养细胞SOCS3表达，随后降调SOCS3表达；中药可能通过MAPK／ERK1／2、PI3K／m TOR而不是STAT3介导的信号通路诱导细胞滋养细胞SOCS3表达及细胞增殖；SOCS3表达变化并不影响ERK磷酸化；SOCS3可能参与了中药的促人细胞滋养细胞生长作用。第三部分补肾益气方促进人滋养细胞和蜕膜基质细胞分泌功能的研究目的了解补肾益气方作用后，人早孕滋养细胞增殖活力与细胞分泌功能之间的关系，分析影响人滋养细胞与蜕膜基质细胞之间相互作用及滋养细胞表达SOCS3的可能因素。方法采用Percoll密度梯度离心法，分离纯化人早孕滋养细胞、蜕膜基质细胞，免疫细胞化学鉴定其纯度；MTT法检测细胞增殖活力，ELISA法检测细胞培养上清中IL-10、IFN-γ，化学发光法检测孕酮、PRL；hIL-10-FITC单标志流式细胞术分析细胞IL-10R表达；Western blot检测SOCS3蛋白表达。结果（1）补肾益气方含药血清作用24h、36h、48h，呈时间-浓度依赖方式增强人早孕滋养细胞增殖活力，同时促进细胞孕酮、IL-10的分泌，上调细胞IL-10R的表达，中药对细胞分泌的IFN-γ无影响；中药促进人滋养细胞增殖活力作用与细胞分泌的孕酮、IL-10／IFN-γ比值之间呈直线正相关关系。（2）补肾益气方含药血清作用蜕膜基质细胞24h、36h、48h，以时间和／或浓度依赖方式促进蜕膜基质细胞PRL、IL-10的分泌，上调细胞IL-10R的表达。（3）IL-10（0.1ng／ml及1ng／ml）作用2h-8h可促进人早孕滋养细胞SOCS3蛋白表达。结论补肾益气方含药血清通过促进人早孕滋养细胞、蜕膜基质细胞激素及IL-10分泌、上调IL-10R表达，加强两种细胞之间的联系；细胞分泌功能的改善上调滋养细胞SOCS3表达，滋养细胞增殖活力又与细胞分泌功能之间相互促进；中药可能通过调控人早孕滋养细胞SOCS3表达改善其生长、分泌等生物学功能。综上所述，本研究系统研究人正常早孕母胎界面SOCS1、SOCS2、SOCS3表达特征，提出母胎界面自分泌和旁分泌的IL-10是SOCS表达的调控因素之一；研究提示补肾益气方通过MAPK／ERK1／2、PI3K／mTOR信号通路调控SOCS3表达、促进人细胞滋养细胞生长，并初步探讨SOCS3在人细胞滋养细胞增殖中的作用；以SOCS3为线索研究人早孕滋养细胞增殖活力和分泌功能的相互促进作用，解析人滋养细胞SOCS3表达与其生物学功能相辅相成的关系。进一步探讨人早孕滋养细胞SOCS3生物学功能将有助于阐明胎盘生长发育、母胎界面免疫内分泌网络平衡的机制。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 人正常早孕母胎界面SOCS1、SOCS2、SOCS3表达及其调控
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 补肾益气方促进人细胞滋养细胞SOCS3表达及其生长
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 补肾益气方促进人滋养细胞和蜕膜基质细胞分泌功能的作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 综述1 SOCS3作用机制及临床研究进展
• 综述2 细胞周期素E与妇科肿瘤
• 攻读博士学位期间发表及待发表的论文及综述
• 致谢