论文摘要
背景和目的结直肠癌（coloretal carcinoma,CRC）是世界上常见的消化道恶性肿瘤。在西方经济发达的国家,结直肠癌的死亡率是仅次于肺癌,居第二位;近二十年来,结直肠癌在我国的发病率总体上呈上升趋势,并随着人类环境、饮食结构和生活方式的改变,结直肠癌的发病率还会继续上升,在中国恶性肿瘤中发病率和死亡率居第4～6位。尽管相对于其它肿瘤来说,结直肠癌的发病机制研究的比较深入,诊治技术和方法也有了很大提高,但仍未取得突破性进展,尤其是进展期结直肠癌的五年生存率仍未得到根本性提高。只有10%～15%的病人能获得早期诊断,大部分住院病人已处于进展期,目前治疗方法仍局限于外科手术和放化疗,总的临床疗效不佳。积极开展结直肠癌发生机制的研究,寻找新的包括肿瘤免疫治疗在内的多种高效特异的治疗手段对于结直肠癌的防治具有重要的现实意义。自上世纪90年代以来,随着T细胞识别机制的阐明,重组DNA技术的发展和肿瘤基因研究的深入,有关肿瘤抗原的性质、表位结构以及利用肿瘤抗原进行抗肿瘤治疗等研究都取得了很大的进展。研制和开发新型抗肿瘤疫苗已成为近年来国际上肿瘤免疫治疗的热点之一。在细胞癌变和肿瘤发生发展的早期非常有必要寻找一个新的分子生物学标记,以提高结直肠癌的早期诊断和治疗技术水平。同时,开展结直肠癌免疫治疗的前提是寻找针对结直肠肿瘤的特异性肿瘤抗原。在众多肿瘤相关抗原中,癌睾丸抗原（cancer/testis antigen,CTA）因其特异的表达模式,即在各种肿瘤组织中均有不同频率的表达,而在正常组织中仅限于睾丸的生殖细胞。因睾丸组织缺乏人类白细胞抗原（HLA）分子,是免疫豁免器官,不会因自体免疫反应对其它组织造成损害。因此,CTA适于作为特异性肿瘤免疫治疗的靶抗原。黑色素瘤抗原基因（melanoma antigen gene,MAGE）是CTA亚家族成员,因其在多种肿瘤细胞的特异性表达及在多种组织类型肿瘤细胞的广泛表达成为多肽疫苗研究的首选,其编码的抗原能被自体细胞毒性T淋巴细胞识别,诱导出对相应肿瘤细胞的特异性杀伤而达到肿瘤治疗的目的。因此,MAGE抗原肽是一种CTL（cytoxic T lymphocytes,CTL）介导的肿瘤特异性免疫治疗的理想靶分子。MAGE基因在转录水平与蛋白表达水平表达有时出现分离的现象,即表达mRNA的组织不一定同时表达蛋白。因此,了解同一组织中基因转录和蛋白表达水平上的分离现象十分必要,因判断以MAGE抗原为基础的肿瘤疫苗可行性的关键步骤是了解这种抗原能否在蛋白水平上表达。研究已表明,基因表达的调控主要通过遗传学（genetics）和表遗传学（epigenetics）两种机制实现。遗传学机制涉及到基因结构的改变,但只能解释肿瘤发病机制中的一部分原因,如基因突变、基因复制时的获得或丢失和染色体异常。还有许多具有重要的功能基因是通过表遗传学机制参与肿瘤的发生、发展。表遗传学是一种不涉及核苷酸序列变化可遗传的基因表达方式的改变,包括DNA甲基化和去甲基化、组蛋白乙酰化和去乙酰化。DNA甲基化是表遗传学的主要修饰形式,是目前研究最深入、最广泛的作用方式。DNA 5-胞嘧啶甲基化改变特别是启动子区CpG岛甲基化是导致基因组不稳定而引发肿瘤的重要机制。许多研究显示启动子5′CpG岛的超甲基化可使原来表达的基因沉默而导致肿瘤的发生,如肿瘤抑制基因、细胞循环调节基因、DNA错配修复基因。可以说启动子区CpG岛异常甲基化是肿瘤发生的早期事件。MAGE基因启动子区CpG岛的甲基化/去甲基化也是调控其表达的重要机制,并已在胃癌、黑色素瘤等肿瘤细胞和组织中观察到,但结直肠癌组织中MAGE基因表达与启动子的去甲基化是否有关,还没有得到完全证实。尽管MAGE基因的研究已有多年,但有关MAGE家族基因在结直肠癌中的表达研究不多,且多是针对欧美人群,针对中国人的研究很少,其表达频率的差异也很大。目前,MAGE基因在结直肠癌组织中的较为准确的表达还不是很清楚,其表达调控的机制也未得到完全证实,在从正常组织、腺瘤到癌组织的发展过程中,MAGE基因启动子去甲基化状态的变化尚未证实。为此,本课题就以下方面进行研究:1.应用RT-PCR和免疫组化技术研究MAGE-A1、-A3、-A4在结直肠癌细胞和组织中的表达,探讨其作为结直肠癌肿瘤免疫治疗的靶抗原以及作为免疫学检测的分子生物学标记物的可能性。2.应用甲基化特异性PCR（MSP）研究MAGE-A1、-A3基因启动子区CpG岛从正常粘膜→腺瘤→癌组织的去甲基化状态,探讨其去甲基化状态与基因表达的关系与临床病理特征的关系,寻找可能有助于结直肠癌早期诊断和具有生物学特征的分子标记物。材料和方法细胞株:HT-29,HCT116、SW116,购自中国医学科学院上海细胞库。标本采集:2006年7月～11月于广西医科大学第一附属医院结直肠外科行手术治疗的65例结直肠癌组织及相应的正常粘膜标本及行手术或纤维结肠镜腺瘤切除治疗的28例腺瘤标本。所有标本均经病理组织学证实。（1）提取结直肠正常粘膜和癌组织的总RNA,用RT-PCR法检测组织中MAGE-A1、-A3和-A4基因mRNA表达频率。（2）应用免疫组化技术（IHC）,检测同一组织标本MAGE-A1、-A3和-A4蛋白的表达。（3）提取正常粘膜、腺瘤和癌组织的DNA,用甲基化特异性PCR（MSP）检测MAGE-A1、-A3基因启动子区CpG岛去甲基化的状态。统计学方法:应用SPSS13.0统计学软件进行数据分析。行×列配对计数资料采用Pearson X2检验或Fisher确切概率法检验,相关性分析采用Spearman相关检验,一致性分析采用Kappa分析。P＜0.05有统计学意义。结果1.RT-PCR结果:1.1细胞株中MAGE-A1、-A3、-A4基因mRNA表达分别为:MAGE-A1,HT-29（-）,HCT116（-）,SW116（+）;MAGE-A3,HT-29（+）,HCT116（+）,SW116（-）;MAGE-A4均为（-）。65例结直肠癌组织中其表达率分别为18.5%（12/65）、33.9%（22/65）和20%（13/65）,53.8%（35/65）的标本至少表达一种抗原基因,相应的正常粘膜组织均未检测到基因的表达。1.2 CRC组织中MAGE-A1和-A3基因表达均与淋巴结转移有关（P=0.023,0.022）,MAGE-A1表达与年龄有关（P=0.011）,与性别、CEA、肿瘤大小和位置、组织分化程度、肿瘤浸润深度及TNM分期无关（P＞0.05）。2.IHC结果:2.1结直肠癌组织MAGE-A1、-A3抗原定位于细胞质,MAGE-A4抗原主要定位于胞质,少部分定位于胞核。2.2 MAGE-A1、-A3、-A4蛋白的表达率分别为15.3%、29.2%、16.9%,正常组织未见表达。MAGE-A1、-A3和-A4蛋白表达均与患者的年龄、性别、CEA、肿瘤大小和位置、侵袭深度及TNM分期之间均无显著性差异（P＞0.05）,但MAGE-A3表达与有无淋巴结转移之间差异有显著性（P=0.004）,且呈正相关（rs=0.392,P=0.001）。2.3 65例CRC组织中MAGE-A1基因mRNA阳性12例,蛋白表达9例（r=0.786,K=0.782＞0.7,P均＜0.01）;MAGE-A3基因mRNA阳性22例,蛋白阳性18例（r=0.827,k=0.822＞0.7,P均＜0.01）;MAGE-A4基因mRNA阳性13例,蛋白阳性11例（r=0.903,K=0.898＞0.7,P均＜0.01）。其中MAGE-A1和-A3各有1例mRNA阴性表达而蛋白呈阳性表达。三种基因的mRNA和蛋白表达均有很高的一致性,呈正相关。3.MSP结果3.1结肠癌细胞株MAGE-A1基因表达与甲基化:HT-29mRNA（-）,M（+）,U（-）;HCT116 mRNA（-）,M（+）、U（+）;SW116 mRNA（+）,M（-）、U（+）。MAGE-A3基因表达与甲基化:HT-29 mRNA（+）,M（+）,U（-）;HCT116mRNA（+）,M（-）,U（+）;SW116 mRNA（-）,M（+）,U（-）。3.2正常组织、腺瘤及癌组织MAGE-A1基因启动子去甲基化阳性率分别为1.5%（1/65）、14.3%（4/28）、29.2%（19/65）;MAGE-A3基因去甲基化阳性率分别为4.6%（3/65）、28.6%（8/28）、47.7%（31/65）。正常组织中两个基因启动子去甲基化率均显著低于腺瘤和癌组织的去甲基化率（P＜0.05）,而腺瘤和癌组织之间比较则没有统计学意义（P＞0.05）。3.3 MAGE-A1、-A3去甲基化状态分别与肿瘤分化程度、有无淋巴结转移有关（P=0.009,0.004;0.042,0.000）,而与性别、肿瘤大小、位置、浸润深度和TNM分期无关（P＞0.05）;MAGE-A1基因启动子去甲基化状态与年龄有关（P=0.001）。3.4将癌组织标本按启动子去甲基化状态分为启动子去甲基化组和甲基化组。MAGE-A1启动子去甲基化组mRNA阳性表达率为57.9%（11/19）,显著高于甲基化组的2.2%（1/46）（r=0.653,K=0.625＞0.4,P均＜0.01）;MAGE-A3启动子去甲基化组的mRNA阳性表达率为64.5%（20/31）显著高于甲基化组的43%（2/46）（r=0.653,K=0.632＞0.4,P均＜0.01）。启动子去甲基化状态与基因表达均具有一致性,呈正相关。3.5将癌组织标本按启动子去甲基化状态分为启动子去甲基化组和甲基化组。MAGE-A1启动子去甲基化组的蛋白表达阳性表达率为47.4%（9/19）显著高于甲基化组的2.2%（1/46）（r=0.570,K=0.525＞0.4,P均＜0.01）;MAGE-A3启动子去甲基化组的蛋白阳性表达率为54.8%（17/31）显著高于甲基化组的5.9%（2/34）（r=0.538,k=0.498＞0.4,P均＜0.01）。两个基因去甲基化水平与其蛋白表达均具有一致性,呈正相关。结论1.结直肠癌细胞株和组织中MAGE-A1、-A3、-A4基因在mRNA和蛋白水平均有表达。MAGE-A3在结直肠癌细胞株和组织中表达较高,具有作为结直肠癌肿瘤免疫治疗靶基因的可能。2.MAGE-A1、-A3基因mRNA表达与淋巴结转移有关,有淋巴结转移的结直肠癌可能伴随较高的表达,且MAGE-A3蛋白表达与有无淋巴结转移呈正相关。3.MAGE-A1、-A3基因启动子去甲基化阳性率在正常组织、腺瘤和癌组织中显著增高,在腺瘤和癌组织中差异无显著性,正常组织很少呈去甲基化状态。CRC中去甲基化状态均与mRNA和蛋白表达呈正相关。4.MAGE-A1、-A3启动子去甲基化状态与淋巴结转移、组织分化程度有关。MAGE-A3基因去甲基化阳性率较高,对预测淋巴结转移、判断组织分化可能有参考价值。5.MAGE-A1、MAGE-A3基因启动子去甲基化在结直肠癌发病早期就存在,贯穿在结直肠癌发生进展的全过程,与基因的转录表达有关,在细胞癌变和肿瘤的发生发展过程中可能起到一个重要的作用。
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