论文摘要
目的1.从眼镜蛇粗毒中分离纯化细胞毒素,并鉴定其理化性质和生物学活性;2.制备眼镜蛇毒细胞毒素PLGA微球,研究其表征及体外释药性质;3.评价眼镜蛇毒细胞毒素PLGA微球瘤体内注射治疗肝癌的药理学作用及安全性;4.探讨眼镜蛇毒细胞毒素PLGA微球抗肝癌作用的相关机制。方法1.眼镜蛇毒细胞毒素的分离纯化、鉴定与生物学活性测定通过凝胶过滤、离子交换等方法从眼镜蛇粗毒中分离纯化眼镜蛇毒细胞毒素;采用SDS-PAGE法测定分离纯化得到的细胞毒素的纯度和分子量,MTT比色法测定纯化的眼镜蛇毒细胞毒素对体外培养细胞的毒性。2.眼镜蛇毒细胞毒素PLGA微球的制备、表征与体外释放行为采用复乳-溶剂挥发法制备眼镜蛇毒细胞毒素PLGA缓释微球,光学显微镜及扫描电镜观察微球表面形态、激光粒度分析仪测定微球大小和分布;BCA法测定载药微球的包封率、载药率、体外释放行为。3.眼镜蛇毒细胞毒素PLGA微球瘤体内注射治疗肝癌作用眼镜蛇毒细胞毒素缓释微球注射到荷人肝癌裸鼠皮下移植肿瘤内,超声定期测量裸鼠肝癌体积,26天后剥离小鼠肝癌肿瘤组织,称质量计算抑瘤率,切除肿瘤组织行病理学检查,评价其抗肿瘤作用。4.眼镜蛇毒细胞毒素PLGA微球抗肝癌作用的相关机制切除肿瘤组织行透射电镜检查,观察凋亡细胞的形态学改变;通过TUNEL法检测细胞凋亡率;免疫印迹法检测眼镜蛇毒细胞毒素对细胞凋亡相关蛋白细胞色素C、caspase-3、-9表达的影响;比色法检测caspase-3、-9的活性;免疫组化法检测PCNA抗原的表达,观察肿瘤细胞增殖抗原的表达。结果1.分离纯化的眼镜蛇毒细胞毒素,SDS-PAGE法证实为均一蛋白区带,分子量约7300u,对体外培养的肝癌细胞具有强烈的细胞毒作用。2.眼镜蛇毒细胞毒素PLGA缓释微球粒径为（34.45±9.85）μm,包封率达（78.13±8.92）%,体外30天累积释放眼镜蛇毒细胞毒素达84.3%。3.眼镜蛇毒细胞毒素PLGA缓释微球瘤体内注射,可显著抑制裸鼠皮下人肝癌移植瘤的生长,肿瘤生长抑制率达52.36%。4.眼镜蛇毒细胞毒素PLGA缓释微球具有抑制人肝癌细胞的增殖,又可诱导人肝癌细胞凋亡及坏死作用。免疫组化法检测PCNA抗原的表达减少,从而抑制肝癌细胞的增殖。光学显微镜和电镜可见细胞凋亡及坏死的典型形态学改变;TUNEL法检测CTX-PLGA微球组细胞凋亡率明显增加;免疫印迹可见CTX-PLGA微球促进细胞色素C从线粒体释放到胞浆,且caspase-3、-9表达量增加;比色法可见caspase-3、-9酶活性增强。结论1.从眼镜蛇粗毒中分离纯化获得的细胞毒素,具有强烈的细胞毒作用;2. PLGA微球是眼镜蛇毒细胞毒素局部注射给药较理想的缓释载体;3.眼镜蛇毒细胞毒素PLGA微球瘤体内注射具有显著的抗肝癌作用;4.眼镜蛇毒细胞毒素PLGA微球通过抑制人肝癌细胞增殖和促进人肝癌细胞凋亡而抑制肿瘤的生长。
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