剑尾鱼HSP70家族两成员的分子克隆及溶藻弧菌感染与免疫对其基因的诱导表达

论文摘要

热应激蛋白（HSPs）是一类存在于所有生物体包括鱼类细胞内比较保守的蛋白,在遇到外界刺激时,能诱导或增强其表达,以保护细胞免受损害。即使在正常无应激情况下,许多HSPs也起着维护细胞正常功能的作用。目前主要根据分子量大小对HSPs进行分类,其中对HSP90、HSP70和低分子量HSPs （16-24 kDa）研究较为广泛。HSP70作为分子伴侣在协助新生多肽链折叠,蛋白质复合体的装配,以及调节、修护和降解变性的蛋白质方面起着重要作用。研究证明一些热应激蛋白可以作为指标测定鱼类的应激状态。鱼体在受到外界环境因子胁迫时,会生成大量的热应激蛋白,这些因素包括工业处理水、重金属离子、亚砷酸盐及寄生虫等环境因子。作为一类存在于包括鱼类在内的所有生物体细胞比较保守的蛋白,热应激蛋白在免疫学方面的应用价值也正日益受到人们的关注。研究表明,人类的许多疾病与人体内热应激蛋白的表达水平有关。由于热应激蛋白参与了生物的多种免疫应答过程,因此,外界刺激诱导生物机体产生热应激蛋白,能够增强生物对某些破坏性因子的抗性。一些病原体内的热应激蛋白尤其是HSP70家族成员具有很强的免疫原性,是免疫系统的主要靶分子。HSP70在疟原虫、锥体虫、血吸虫、利什曼原虫和分支杆菌的感染中起重要的产生免疫原性的作用。真菌中的结节型组织胞浆菌的一HSP70家族成员是细胞免疫的主要靶子。HSP70是含量最丰富的一大家族HSPs,具有高度保守的序列以及在受到环境胁迫后能够大量表达,因此以热应激蛋白70作为指标来测定鱼类的应激状态,包括感染或免疫状态可能是较为理想的选择。本研究的目的是以溶藻弧菌为代表病原菌,以标准水生实验动物剑尾鱼（Xiphophorus helleri）为实验对象,在病原菌感染或免疫处理后的不同时间点,分别无菌采取肝脏、心脏、头肾和脾脏组织,从mRNA表达水平上了解剑尾鱼HSP70基因的动态表达水平。在不同时间点,取脾脏淋巴细胞体外培养,检测剑尾鱼淋巴细胞增殖和白细胞介素-2活性。以期找出HSP70基因表达与剑尾鱼病原菌感染与免疫状态的关系。HSP70的基因表达采用半定量RT-PCR方法,淋巴细胞增殖和白细胞介素-2活性采用MTT法。结果表明:1.弧菌中的一种感染性较强的溶藻弧菌能感染剑尾鱼,半数致死量为2.0×108CFU/g。2.由于目前并无剑尾鱼HSP70基因序列的相关报道,本文首次得到了剑尾鱼HSP70两个成员基因的部分序列。采用RT-PCR方法扩增了实验动物剑尾鱼（Xiphophorus helleri）纯系RR-B的HSP70家族两个新成员的cDNA片段,并将其克隆到PMD18-T载体中测序,

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 实验动物-剑尾鱼简介
• 2 病原弧菌的研究概况
• 3 鱼类的免疫系统与抗感染免疫
• 3.1 鱼类的免疫系统
• 3.2 抗感染免疫
• 3.2.1 体液免疫系统
• 3.2.2 细胞免疫
• 3.2.3 环境因子对鱼类免疫能力的影响
• 4 鱼类疫苗的研究及疫苗评价
• 4.1 鱼类疫苗的研究
• 4.2 目前鱼用疫苗的评价现状及存在的问题
• 5 热应激蛋白70 的研究进展
• 5.1 HSP70 的类型及特点
• 5.2 热应激蛋白的基因表达调节
• 5.3 HSP70 在组织中的表达
• 5.4 HSP70 的生物学功能
• 5.4.1 HSP70 的分子伴侣作用
• 5.4.2 HSP70 参与细胞骨架的形成与修复
• 5.4.3 HSP70 调节酶的活性
• 5.4.4 HSP70 调节细胞功能
• 5.4.5 HSP70 具有免疫调节功能
• 5.5 感染对 HSPs 基因表达的影响
• 5.6 热应激蛋白在水产中的应用
• 6 本论文的目的、意义
• 第一章 溶藻弧菌对剑尾鱼致病性及组织病理学研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验鱼
• 1.2 菌株
• 1.3 人工感染试验
• 1.4 病原菌的再分离和生理生化特性鉴定
• 1.5 病理组织切片制作与观察
• 1.5.1 石蜡包埋
• 1.5.2 切片
• 1.5.3 染色
• 2 结果
• 2.1 病原菌的分离及感染试验
• 2.2 病原菌的生化鉴定结果
• 2.3 病理组织学变化
• 3 讨论
• 第二章 剑尾鱼HSP70 家族两成员cDNA 基因克隆与序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 菌株和载体
• 1.1.3 主要药品和试剂
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 常用溶液及缓冲液
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 剑尾鱼总RNA 提取
• 1.2.2 引物设计
• 1.2.3 剑尾鱼cDNA 模板第一链的合成
• 1.2.4 核心片段的扩增
• 1.2.5 琼脂糖凝胶电泳回收与纯化PCR 产物
• 1.2.6 载体与基因的连接
• 1.2.7 重组质粒的转化
• 1.2.8 转化子的筛选与鉴定
• 1.2.9 基因序列测定与分析
• 2 结果
• 2.1 总RNA 的提取
• 2.2 HSP70 家族两成员的序列分析
• 3 讨论
• 3.1 HSP70 的转录调控
• 3.2 HSP70 的翻译
• 3.3 HSP 的降解
• 第三章 热应激对剑尾鱼组织内HSP70 两成员mRNA 表达影响
• 1 材料与方法
• 1.1 实验鱼类
• 1.2 热应激
• 1.3 半定量测定HSP70 两成员的表达
• 2 结果
• 2.1 热应激下HSP70 两家族成员在剑尾鱼组织内的表达
• 3 讨论
• 3.1 HSP70 与细胞的耐热性
• 3.2 热休克反应的调节
• 3.3 HSP 增强热耐受性的机制
• 3.3.1 分子伴侣作用
• 3.3.2 抗氧化作用
• 3.3.3 抗细胞凋亡作用
• 3.3.4 协同免疫作用
• 第四章 溶藻弧菌感染对剑尾鱼组织内HSP70 两成员mRNA 表达的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 实验鱼类
• 1.2 实验条件
• 1.3 溶藻弧菌感染
• 1.4 RT-PCR 测定 HSP70 两成员的表达
• 2 结果
• 2.1 溶藻弧菌感染对HSP70 成员一基因在剑尾鱼组织内表达的影响
• 2.2 溶藻弧菌感染对HSP70 成员二基因在剑尾鱼组织内表达的影响
• 3 讨论
• 3.1 抗感染免疫
• 第五章 溶藻弧菌疫苗免疫后对剑尾鱼组织内HSP70两成员mRNA表达的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 溶藻弧菌灭活疫苗制作
• 1.2 疫苗的安全性检测
• 1.3 实验条件
• 1.4 实验方法
• 2 结果
• 2.1 溶藻弧菌疫苗免疫前后对 HSP70 成员一基因在剑尾鱼组织内表达的影响
• 2.2 溶藻弧菌疫苗免疫前后对 HSP70 成员二基因在剑尾鱼组织内表达的影响
• 3 讨论
• 3.1 HSP70 与抗原呈递
• 3.2 HSP70 与免疫反应
• 第六章 溶藻弧菌感染和免疫对剑尾鱼T 淋巴细胞增殖及 IL-2 活性的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 仪器与试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 实验用溶藻弧菌制作
• 1.2.2 实验用灭活疫苗制作
• 1.2.3 实验动物分组、处理及被检材料的采取
• 1.2.4 检测指标及其方法
• 1.3 数据处理
• 2 结果
• 2.1 溶藻弧菌感染和免疫后剑尾鱼脾脏IL-2 诱生活性变化
• 2.2 溶藻弧菌感染和免疫后剑尾鱼脾脏 T 淋巴细胞增殖变化
• 3 讨论
• 3.1 淋巴细胞
• 3.2 1L-2 的生物学特性及其种属特异性
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况