密花石斛多糖的提取分离及其初步生物活性研究

论文摘要

密花石斛为兰科石斛属植物,该属植物所含化学成分类型多样,除生物碱外,还有菲类、联苄类、多糖、香豆素类、倍半萜类、甾体以及挥发油等,其中石斛多糖类成分具有抗肿瘤、增强免疫力、降低血糖等药理作用。深入研究表明：石斛属植物活性作用的强弱与其水溶性多糖含量之间存在正相关性,且植物中的酸性多糖往往具有较大的生物活性；但是有关密花石斛水溶酸性多糖类化学成分及其生物活性作用的研究迄今鲜见报道。本研究通过正交设计试验优选出密花石斛粗多糖提取工艺；采用DEAE-52纤维素柱分离纯化密花石斛粗多糖,分别获得4种酸性多糖成分（PGM1、PGM2、PGM3、PGM4）;利用凝胶过滤法通过Sephadex G-100层析柱分别测出4种酸性多糖的相对分子质量,并对酸性多糖相对分子质量与酸性多糖的酸性强弱之关联性进行了探讨。在生物学初步研究中,通过体外脾细胞增殖试验和抗肿瘤生长抑制试验结果综合比较四种酸性多糖之间药效学活性大小,得出密花石斛水溶酸性多糖酸性大小与其药效学作用之间的关系,初步认为药效学作用较好的一段密花石斛水溶酸性多糖相对分子质量之区间。目的：1.筛选和优化密花石斛多糖提取工艺,采用正交设计法,以提取率为考察指标,以加热温度（50℃、70℃、90℃）、料液比（10倍、20倍、30倍）、提取时间（1小时、2小时、3小时）、提取次数（1次、2次、3次）为考察因素,优选药材的最佳提取条件。2.分离纯化密花石斛粗多糖。采用DEAE-52纤维素柱,根据酸性基团增加则多糖成分在DEAE-52纤维素柱上吸附力随之增加的原理,以不同浓度的NaCl溶液分段梯度洗脱DEAE-52纤维素柱,分别得到4种酸性程度不同的的密花石斛多糖成分（PGM1、PGM2、PGM3、PGM4）。3.采用凝胶过滤法,通过Sephadex G-100柱分别测出4种密花石斛酸性多糖的相对分子质量,探讨密花石斛酸性多糖之间的酸性强弱与其相对分子质量的关联性。4.研究4种密花石斛酸性多糖（PGM1、PGM2、PGM3、PGM4）对正常小鼠脾细胞增殖的影响,并比较其作用强弱。5.研究4种密花石斛酸性多糖（PGM1、PGM2、PGM3、PGM4）对人肺瘤细胞A549和人肝瘤细胞G2生长抑制的影响,比较其作用强弱。6.根据脾细胞增殖试验和抗肿瘤生长抑制试验,综合比较四种密花石斛酸性多糖药效学活性作用之强弱。结合各酸性多糖的酸性强弱,得出药效学作用与酸性多糖酸性强弱的关系。方法：1.分别取10g密花石斛粉末,按L9（34）正交设计实验方案,各自加入不同倍数的去离子水,分别在特定温度下提取一定时间和次数,提取液过滤,合并之,浓缩至15ml。加45ml（3倍体积量）95%乙醇过夜,离心,沉淀物加去离子水溶解,sevage法去除蛋白后得密花石斛粗多糖。准确称取一定量密花石斛粗多糖,去离子水溶解、稀释后定容。采用硫酸-苯酚法测定其多糖含量,每一试验平行2次,取平均值进行正交试验结果分析,找出最佳提取工艺。2. DEAE-52纤维素柱层析分离密花石斛粗多糖之中性糖和酸性多糖。取密花石斛粗多糖1.0g,溶于30ml去离子水中上样,分别用去离子水、0.05mol·L-1、0.1mol·L-1、0.2mol·L-1、0.3 mol·L-1、0.4mol·L-1、0.5mol·L-1 NaCl分段梯度洗脱,按5ml／管收集洗脱液。苯酚-硫酸法显色,测其吸光度,绘制洗脱曲线,合并各浓度洗脱液主峰段的溶液,透析24h（透析袋截留相对分子质量为3500D）,留存透析袋内母液,合并后减压浓缩,加3倍体积量95%乙醇,离心后烘干沉淀物,得各浓度NaCl洗脱的酸性多糖干燥品。3.凝胶过滤法求相对分子质量（1）绘制相对分子质量的标准曲线使用Sephadex G-100柱层析,将已知相对分子质量的Dextran T-5、T-40、T-70（重均相对分子质量分别为5000、40000、70000D）相继上柱,上样量为2.5mg,用去离子水进行洗脱,苯酚-硫酸法显色,测吸光度,已洗脱体积为横坐标,吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线,分别得出洗脱体积Ve。用Dextran T-2000同法测得柱床体积Vo。以Ve/Vo为横坐标,相对分子质量对数（logM）为纵坐标,绘制标准曲线,求出回归方程。（2）密花石斛酸性多糖相对分子质量的测定将PGM1、PGM2、PGM3、PGM4同法相继上柱,测得Ve,将Ve/Vo带入回归方程算出各样品的相对分子质量。4.脾细胞增殖试验：取正常小鼠脾脏,常规制备脾细胞悬液,加入密花石斛酸性多糖（PGM1、PGM2、PGM3、PGM4）,终浓度为100、50、25μg/ml。在37℃下培养44h,加入5mg/ml MTT溶液20μl,继续培养4h,弃上清,加DMSO振摇,于λ=570nm处测吸光度。5.抗肿瘤生长抑制试验：将处于对数生长期的人肺癌A549细胞用胰酶消化,制成细胞悬液,培养24h,加入密花石斛酸性多糖（PGM1、PGM2、PGM3、PGM4）,终浓度为200、100、50μg/ml。在37℃下培养44h,加入5mg/ml MTT溶液20μl继续培养4h,弃上清,加DMSO振摇,于λ=570nm处测吸光度。计算抑制率（抑制率%=（1-加药组细胞平均吸光值／对照组平均吸光值）×100%）。人肝癌G2细胞生长抑制率试验方法同人肺癌A549。结果：1.加热温度、料液比、提取时间与提取次数对提取工艺中多糖含量均有显著性影响,其影响程度依次为A>D>C>B,即加热温度>回流次数>回流时间>料液比。最佳提取工艺为A3B2C2D3,即：90℃、20倍去离子水、回流2次、每次3h。本试验优选出的提取工艺为密花石斛多糖提取工业化生产有一定参考价值。采用本提取工艺条件,对密花石斛进行两次平行试验,提取结果取平均值,得出密花石斛粗多糖提取率为3.15%。2.经DEAE-52纤维素柱层析分离后,所得密花石斛中性多糖成分占密花石斛总多糖的大部分,密花石斛酸性多糖成分较少,且其量随NaCl浓度的增大而逐渐减少。为保障有足够量密花石斛酸性多糖成分开展后续药理实验,本课题研究中选定前四个浓度NaCl洗脱的酸性多糖作为实验样品,即洗脱液分别为0.05mol·L-1、0.1mol·L-1、0.2mol·L-1、0.3 mol·L-1 NaCl水溶液,对应密花石斛酸性多糖干燥品依次命名为PGM1、PGM2、PGM3与PGM4,且其酸洗强度大小为PGM4>PGM3>PGM2>PGM1。3.以凝胶过滤法测试Dextran T-5、T-40、T-70和Dextran T-2000四个标准品,经计算得出多糖相对分子质量回归方程为：y=-0.4141x+5.362, r=0.9984。多糖相对分子质量对数在3.699～4.845范围内呈线性。本实验研究中四种密花石斛酸性多糖的相对分子质量均不相同,且每种密花石斛酸性多糖的相对分子质量也不单一,都有2～3个主要相对分子质量分布区域,分布在5000-70000之间。为方便比较起见,本文将5000-70000划分成三个区域,即Ⅰ区（70000-50000）D、Ⅱ区（50000-28000）D、Ⅲ区（10000-5000）D,并计算了每种密花石斛酸性多糖相对分子质量在各个区域所占的百分比重。4.脾细胞增殖试验表明：除PGM1 （25μg/ml）外,PGM1 （100、50μg/ml）、PGM2、PGM3、PGM4 （100、50、25μg/ml）均可明显促进正常脾细胞增殖（P<0.05）,且在一定范围内有浓度依赖趋势。4种密花石斛酸性多糖对脾细胞增殖的促进作用强度,整体比较为PGM4> PGM2> PGM3> PGM 1。5.体外抗人肺癌A549细胞增殖实验证实：PGM4、PGM3和PGM2（50、100、200μg/ml）. PGM1（100μg/ml）均能显著性抑制肿瘤细胞增殖（P<0.05）；在抗人肝癌A549细胞增殖实验中：PGM4、PGM3 （50、100、200μg/ml）和PGM2（200μg/ml）对G2细胞的增殖表现出了明显的抑制作用。整体比较,抗人肺癌A549和人肝癌A549两个试验中四种密花石斛酸性多糖表现为同一作用趋势,即：PGM4> （PGM2、PGM3）> PGM1,其中PGM2和PGM3作用非常接近。6.综合四种密花石斛酸性多糖脾细胞增殖试验、抗肿瘤生长抑制试验及其相对分子质量测定数据,生物学活性作用以密花石斛酸性多糖PGM4最强,其相对分子质量集中在Ⅱ区和Ⅲ区,偏重于Ⅲ区（45.03%）,实际上另3种密花石斛酸性多糖PGM1、PGM2与PGM3的相对分子质量也多处在Ⅲ区,由此可初步认为相对分子质量集中在（10000-5000）D区间的密花石斛酸性多糖,其生物活性药效相对较强,而集中于Ⅱ区（50000-28000）D者则相对较弱。由于PGM2和PGM3在Ⅰ区（70000-50000）D均占20%以上,说明相对分子质量处于Ⅰ区的密花石斛酸性多糖也存在部分生物活性作用。考虑到生物活性作用最强的PGM4在Ⅰ区仅占6.5%,故较难比较Ⅰ区与Ⅲ区密花石斛酸性多糖生物学活性作用之强弱,留待后续研究。结论：1.筛选到的最佳提取工艺为：90℃、料液比为1：20、回流2次、每次3h,此工艺对密花石斛多糖提取工业化生产具有一定参考价值。2.密花石斛多糖混合物中以中性多糖成分为主,其酸性多糖成分较少,且酸性多糖的含量随酸性基团的增加而降低。4个密花石斛酸性多糖的酸性强度为：PGM4>PGM3>PGM2>PGM1。3.虽然PGM1、PGM2、PGM3、PGM4酸性逐渐增强,但这4种密花石斛多糖的相对分子质量分布均较宽,以本实验研究结果暂不能对PGM1、PGM2、PGM3、PGM4之间的相对分子质量大小进行排序,故初步判断密花石斛多糖的酸性强弱与其相对分子质量之间没有直接关联性。4.结合酸性多糖的酸性强弱和药效学试验,初步得出生物学活性与密花石斛酸性多糖的酸性强度成正比。5.密花石斛酸性多糖相对分子质量集中在Ⅰ区（70000-50000）D、Ⅱ区（50000-28000）D和Ⅲ区（10000-5000）D的物质可能有生物学活性,以相对分子质量集中在Ⅲ区的密花石斛酸性多糖药效作用可能最强。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 材料和方法
• 1.主要仪器
• 2.动物与瘤株
• 3.药品与试剂
• 4.实验方法
• 第三章 结果
• 1.密花石斛提取物中多糖的含量
• 2.正交试验数据分析
• 3.密花石斛粗多糖的分离（DEAE-52纤维素柱层析）
• 4.密花石斛酸性多糖的相对分子质量测定（Sephadex G-100柱层析）
• 5.密花石斛酸性多糖对脾细胞增殖的影响
• 6.密花石斛酸性多糖对人肺癌A549、肝癌G2细胞生长抑制的影响
• 第四章 讨论
• 1.密花石斛多糖提取正交试验及含量测定
• 2.密花石斛粗多糖的分离
• 3.密花石斛酸性多糖的初步生物活性实验
• 4.密花石斛酸性多糖的酸性强弱与生物学活性的关系
• 5.密花石斛酸性多糖的相对分子质量与生物学活性
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录 中英文缩略词对照表
• 攻读学位期间成果
• 致谢
• 统计学证明