Apelin对肺微血管内皮细胞保护作用的实验研究

论文摘要

第一部分:血管紧张素Ⅱ对肺微血管内皮细胞Apelin-APJ mRNA表达的影响目的研究血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对肺微血管内皮细胞Apelin-APJ mRNA表达的影响。方法培养新生鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）,利用RT-PCR检测PMVECsApelin-APJmRNA表达。取2-4代细胞,以5×105个/孔密度接种至6孔板,培养至80%融合后,进行药物干预实验:①加AngⅡ入6孔板中,至终浓度分别为0、10-9、10-8、10-7、10-6M（mol/L）,每组设立4个复孔,继续培养24h终止实验,检测不同浓度AngⅡ对PMVECs Apelin-APJmRNA表达的影响;②加AngⅡ入6孔板至终浓度为10-7M,分别在0h、1h、6h、12h、24h、48h时间点终止实验。同时在0h、24h、48h点设立空白对照,加入等体积PBS。每组4个复孔。检测不同时间点10-7M AngⅡ对PMVECs Apelin-APJmRNA表达。结果①PMVECs存在Apelin-APJmRNA表达。②与对照组（OM AngⅡ）比较,10-9M AngⅡ作用24h后Apelin mRNA表达上调（P＜0.01）,随着AngⅡ浓度上升,Apelin mRNA表达呈浓度依赖性持续下调（P＜0.05或P＜0.01）;不同浓度AngⅡ(10-9-10-6M)呈浓度依赖性导致APJmRNA表达下降（P＜0.05或P＜0.01）。③10-7MAngⅡ作用于PMVECs后,Apelin mRNA表达在6h内增加（P＜0.05）,其中在1h达到高峰（P＜0.01）,6h后Apelin mRNA表达随时间延长明显降低（P＜0.01）;APJ mRNA表达在0h-12h内有增加趋势,12h后APJ mRNA表达随10-7M AngⅡ作用时间延长明显下调（P＜0.01）;0h、24h、48h时间点空白对照Apelin-APJmRNA表达无明显改变（P＞0.05）。结论AngⅡ对PMVECs Apelin-APJ基因表达水平有明显影响,Apelin-APJ系统可能参与AngⅡ对内皮细胞损伤机制。第二部分:Apelin对肺血管内皮细胞增殖和凋亡的影响目的探讨Apelin对肺血管内皮细胞增殖与凋亡的影响。方法培养新生大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）,取2-4代PMVECs用于实验:①以2000个/孔的密度接种至96孔板,分为3组:对照组加入等容量PBS;低浓度组(10-8M Apelin组)加入10-6M Apelin;高浓度组(10-6M Apelin组)加入10-6MApelin。每组6个复孔。48h后用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）检测各组OD值,计算细胞增殖率。②以5×105传代至25ml的培养瓶,分为5组:对照组加入等容量PBS;低浓度组(10-8M Apelin组)加入10-8M Apelin;高浓度组(10-6M Apelin组)加入10-6M Apelin;AngⅡ组加入10-7M AngⅡ;AngⅡ+Apelin组加入10-8MApelin,10min后加入10-7M AngⅡ。每组5个复孔。24h后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果①与对照组比较,低浓度Apelin和高浓度Apelin都可导致PMVECs OD值增加,增殖率增加2.5倍以上（P＜0.01）。低浓度组和高浓度组之间没有统计学差异。②与对照组比较,低浓度Apelin组和高浓度Apelin组的PMVECs凋亡率降低50%以上（P＜0.05）,AngⅡ组PMVECs凋亡率明显升高（P＜0.01）;与AngⅡ组比较,AngⅡ+Apelin组PMVECs凋亡率明显降低（P＜0.01）。结论Apelin促进体外培养大鼠PMVECs增殖,抑制PMVECs凋亡。第三部分:Apelin对肺微血管内皮细胞保护作用及其释放NO的机制研究目的探讨Apelin对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导肺血管内皮细胞释放ET-1的影响和刺激一氧化氮（NO）的释放机制。方法培养新生鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）,取2-4代PMVECs用于实验。①Apelin在不同时间点对PMVECs释放NO的影响:以1×105个/孔密度接种至24孔板,80%融合后,无血清培养24h,分为2组:Apelin组,加入Apelin至终浓度为10-8M;对照组,加入等量无血清DMEM培养液。每组设立4个复孔。继续培养,并分别在0min、2min、5min、15min、30min五个时间点取培养液测NO浓度。②Apelin对AngⅡ诱导PMVECs释放ET-1的影响:分为4组:AngⅡ组,加入AngⅡ至终浓度为10-7M;AngⅡ+10-8M Apelin组,加入10-7M AngⅡ前5min加入10-8M Apelin预处理;AngⅡ+10-6M Apelin组,加入10-7M AngⅡ前5min加入10-6M Apelin预处理;对照组,加入等量无血清DMEM培液。每组设立4个复孔。继续培养,并分别在0min、30min、6h、24h四个时间点取培养液检测ET-1浓度。③Apelin对PMVECs Akt/eNOS磷酸化影响:以5×105个/孔密度接种至6孔板,80%融合后,无血清培养24h,分为3组:Apelin组,加入Apelin至终浓度为10-8M;Apelin+Akt inhibitor组,加入Apein前用5uM浓度的Akt抑制剂预处理30min;对照组,加入等量DMEM培液。每组设立3复孔。继续培养5min后立即提取总蛋白,用于Western Bolt检测磷酸化Akt和磷酸化eNOS表达。结果①Apelin在不同时间点对PMVECs释放NO的影响:在PMVECs培养液中加入10-8M的Apelin后,与对照组比较,培养液中NO浓度在2min、5min、15min时间点都出现增加（P＜0.01或P＜0.05）;其中在5min时间点达到高峰（与对照组比较,P＜0.01）;在30min时间点,NO浓度与对照组比较无统计学差异。②Apelin对AngⅡ诱导PMVECs释放ET-1的影响:与对照组比较,AngⅡ组培养液中30min、6h、24h时间点的ET-1浓度都明显升高（P＜0.05）。与AngⅡ组比较,AngⅡ+10-8M Apelin组培养液中30min、6h、24h时间点的ET-1浓度都明显降低（P＜0.05）,接近对照组。与AngⅡ组比较,AngⅡ+10-8 Apelin组的ET-1浓度有降低趋势,但无统计学意义。③Apelin对PMVECs Akt/eNOS磷酸化影响:与对照组比较,Apelin组PMVECs Akt和eNOS磷酸化表达明显增加（P＜0.01）。与Apelin组比较,Apelin+Akt inhibitor组PMVECs eNOS磷酸化表达明显降低（P＜0.01）。结论Apelin能促进PMVECs释放NO,抑制AngⅡ诱导的ET-1释放。Akt/eNOS磷酸化增加是Apelin促进NO释放机制之一,并可能参与细胞保护。

论文目录

• 缩略词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 血管紧张素Ⅱ对肺微血管内皮细胞Apelin-APJ mRNA表达的影响
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 第二部分 Apelin对肺血管内皮细胞增殖和凋亡的影响
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 第三部分 Apelin对肺微血管内皮细胞保护作用及其释放NO的机制研究
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 综述
• 附录