植物发育突变体的蛋白质组学研究

论文摘要

蛋白质组学研究在功能基因组时代发挥着越来越重要的作用。蛋白质组研究旨在研究基因组编码的整套蛋白质的结构和功能,从而补充转录组的研究。目前,基因突变引起的蛋白质表达变化是蛋白质组学研究的重要内容。拟南芥和水稻是植物分子生物学研究中两种重要的模式植物。本文以新筛选的拟南芥突变体和实验室已有的水稻突变体为材料,利用蛋白质组学方法分别研究了它们发育突变体中蛋白质表达谱的变化,获得了以下主要研究结果。（1）拟南芥发育突变体的筛选研究以拟南芥蓝光受体双突变体cry1cry2为实验材料,通过激活标签技术构建了T-DNA插入突变体库,并从中筛选到6个与开花时间有关和2个矮化的发育突变体。采用质粒拯救（plasmid rescue）、IPCR（inverse PCR,反向PCR）和TAIL-PCR（Thermal asymmetric interlaced-PCR,热不对称巢式PCR）等方法,分析得出了这些发育突变体T-DNA插入位点的基因组侧翼序列。通过RT-PCR方法分析了突变体T-DNA插入位点两侧基因的表达情况,结果表明突变体表型的变化可能是T-DNA插入后35S强启动子引起附近的基因表达量增加造成的,从而进一步证实了这些发育突变体的突变分子基础。通过筛选发育突变体和鉴定相关基因,为深入研究植物光周期开花调控以及下胚轴伸长抑制的机理奠定了基础。（2）水稻和拟南芥育性突变体的蛋白质组学研究通过双向电泳、MALDI-TOF质谱、MALDI-TOF-TOF质谱等技术比较分析了水稻株1S不育和可育条件下花粉母细胞形成期,减数分裂期以及花粉内容物充实期（第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ期）的幼穗蛋白的动态变化过程。结果发现水稻株1S在不育和可育条件下,分别在幼穗第Ⅴ期有43个差异蛋白质点,第Ⅵ期有32个差异蛋白质点,第Ⅶ期有23个差异蛋白质点。选取其中50个蛋白用于质谱鉴定,最后有20个差异蛋白质点得到了鉴定,分析后发现这些蛋白主要参与了糖代谢,能量代谢,蛋白质的生物合成,细胞壁形成和胁迫响应等与花粉发育相关的过程。通过RT-PCR方法对其中3个蛋白质对应基因进行表达分析,结果发现其中1个蛋白质的表达与相应mRNA水平的表达相一致,另外2个蛋白质的表达与其mRNA水平的表达不一致,表明后2个蛋白质对应基因可能由于基因表达存在翻译后修饰。我们共得到了8个与育性相关的蛋白,其中UDP-葡糖醛酸脱羧酶、咖啡酰辅酶A-氧-甲基转移酶和OSJNBa0060D06.10蛋白与育性转换紧密关联。这些分析结果表明温度控制水稻的育性是通过共调节相关基因的表达而实现的,初步从蛋白质水平阐述了温敏核不育水稻育性转换的分子机理。选取筛选到的拟南芥晚开花突变体scc106-D和对照材料cry1cry2作为研究对象,比较了两者生长在白光下的蛋白质水平差异,通过质谱分析最后鉴定得到了22个差异蛋白质点,并发现其中17个蛋白在scc106-D突变体中同时下调,而另有3个蛋白仅在cry1cry2中表达。分析鉴定得到的差异蛋白发现,它们主要参与了碳水化合物代谢、能量代谢、硫代谢、光合作用、光呼吸、胁迫响应和蛋白质的合成等过程,其中光合蛋白占36%,能量相关蛋白占14%。结果说明光合速率下降和能量降低可能是使突变体发育迟缓,开花延迟,育性降低,下胚轴变短的主要原因。这些结果提示,T-DNA插入后35S强启动子引起附近的基因表达量增加,在光作用下调节相关基因的表达从而导致突变体表型的变化。（3）水稻和拟南芥矮化突变体的蛋白质组学研究采用双向电泳技术分离水稻株1S、矮秆突变体SV14和湘陵628S的茎蛋白,通过质谱鉴定得到了33个差异蛋白质点。其中在矮秆突变体SV14中27个蛋白点下调,1个仅在SV14中表达,2个仅在株1S中表达:在湘陵628S中25个蛋白点下调,1个仅在湘陵628S中表达,3个仅在株1S中表达。通过分析可以将这些差异蛋白分为两大类:第一类是调节性蛋白,如咖啡酸三氧转甲基酶,热激蛋白70,醛酮变位酶I,肌动蛋白等,它们主要参与蛋白质的合成和加工、胁迫响应、细胞骨架稳定等过程;第二类是功能性蛋白,如抗坏血酸过氧化物酶,细胞质苹果酸脱氢酶,细胞质磷酸甘油酸激酶,S-腺苷蛋氨酸合成酶,ATP合酶等,它们则参与氧化还原平衡、光合作用、光呼吸和各种代谢等过程。调节性蛋白丰度的下调可能引起了水稻发育的迟缓,功能性蛋白活性和丰度的改变,则主要破坏水稻植株细胞内的代谢平衡,两者共同作用从而最终导致茎变短和植株变矮。该结果从蛋白质表达水平阐述了水稻植株矮化的内在原因,为进一步开展水稻矮秆分子育种奠定了基础。选取筛选到的矮化突变体scc8-D和对照材料cry1cry2作为研究对象,比较了两者生长在白光下的蛋白质水平的差异。通过质谱分析共鉴定得到了22个差异蛋白质点,其中有16个蛋白在scc8-D突变体中都是下调的,同样有3个蛋白仅在cry1cry2中表达。经分析发现这些差异蛋白可能参与了碳水化合物代谢、光合作用、光呼吸、胁迫响应、蛋白质的合成和氧化还原平衡等过程,其中光合蛋白占32%。此结果进一步说明调节性蛋白和功能性蛋白丰度的表达受到光调控从而抑制植物下胚轴的伸长。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写词
• 第1章 绪论
• 1.1 蛋白质组学研究概述
• 1.2 水稻和拟南芥的蛋白质组学研究
• 1.2.1 水稻蛋白质组学研究
• 1.2.2 拟南芥蛋白质组学研究
• 1.3 水稻和拟南芥突变体的研究
• 1.3.1 水稻突变体的研究
• 1.3.2 拟南芥突变体的研究
• 1.4 本论文工作设想
• 第2章 拟南芥发育突变体的筛选和鉴定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料和仪器
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 拟南芥发育突变体的筛选
• 2.2.2 矮化突变体T-DNA 插入位点的鉴定
• 2.2.3 晚开花突变体T-DNA 插入位点的鉴定
• 2.2.4 早开花突变体T-DNA 插入位点的鉴定
• 2.2.5 突变体基因的鉴定
• 2.2.6 拟南芥突变体幼苗下胚轴分析
• 第3章 水稻和拟南芥育性突变体的蛋白质组学研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料和仪器
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 水稻株 1S 不育与可育条件下幼穗蛋白质组学研究
• 3.2.2 拟南芥晚开花突变体scc106-D 的全蛋白组学研究
• 第4章 水稻和拟南芥矮化突变体的蛋白质组学研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料和仪器
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 水稻株1S的矮秆突变体茎蛋白质组学研究
• 4.2.2 拟南芥矮化突变体scc8-D 的全蛋白组学研究
• 结论
• 参考文献
• 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录
• 致谢