致病性大肠杆菌致细胞线粒体功能障碍和粘附脱落损伤效应分子作用研究

论文摘要

目的:1、探讨致病性大肠杆菌（EPEC）感染宿主上皮细胞后,效应分子EspH的转位、分布以及在EPEC致宿主细胞粘附、脱落损伤（A/E）中的作用。2、探讨EPEC感染Hela细胞后,效应分子在EPEC致Hela细胞线粒体功能障碍中的作用。3、探讨EPEC感染TC-7细胞,参与细菌粘附及引起肠上皮细胞微绒毛脱落损伤的效应分子。方法:1、分别用PCR方法扩增espH基因紧邻上游DNA片段（约500 bp）、卡那霉素开放读码框（约1200 bp）和espH基因下游DNA片段（约500 bp）,按顺序把三个DNA片段串联克隆到PCR克隆载体pSC-A中,再亚克隆该大片段（约2200bp）到自杀质粒pCVD442中得到自杀质粒pCVD442-ΔespH::kana,通过结合传递、等位交换,抗性筛选制备EPECΔespH删除株,并对删除株进行PCR鉴定和相应染色体DNA区段做测序鉴定;构建带HA标签的EspH表达载体pTrc99a-EspH:HA,电转化载体到ΔespH删除株制备ΔespH/pTrc99a-EspH:HA,并用其感染Hela细胞,Western Blot和免疫荧光技术检测EspH的转位以及转位后EspH的分布;构建EspH和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合表达质粒pEspH-EGFP,转染Hela细胞,荧光显微镜观察融合蛋白的分布;并用ΔespH删除株感染Hela、Caco-2和TC-7细胞,分别用荧光显微镜技术,跨上皮细胞电阻（TER）检测和扫描电子显微镜（SEM）技术探讨EspH在基垫形成,屏障功能障碍和微绒毛脱落损伤中的作用。2、通过结合传递、等位交换,抗性筛选制备ΔespF、Δmap、Δmap espF等删除株,并用PCR和Western Blot对删除株进行鉴定;用制备的删除株和其他效应分子删除株、质粒表达相应效应分子互补株或染色体表达效应分子互补株感染经用线粒体膜电位试剂盒JC-1染色的Hela细胞,并用多功能酶标仪检测感染前后线粒体膜电位（MMP）的改变,Western Blot和免疫荧光技术检测效应分子的转位及分布,从而探索效应分子在EPEC致线粒体功能障碍中的作用及可能机制。3、分别用EPEC野生型、III型分泌系统（T3SS）删除株Δcfm-14、束状菌毛（BFP）删除株ΔbfpA以及其他效应分子删除株感染经极化培养的TC-7细胞,通过扫描电镜检测参与A/E损伤的效应分子,并用质粒表达相应蛋白互补删除株,证实效应分子在A/E损伤中的作用。结果:1、酶切、测序及PCR鉴定表明自杀质粒pCVD442-ΔespH::kana成功构建;PCR和测序鉴定表明:ΔespH删除株构建成功,卡那霉素基因取代espH基因,且ΔespH删除株获得卡那霉素抗性;感染Hela细胞以后,对细胞组分分离,Western Blot检测发现:EspH依赖于T3SS转位到宿主细胞,并在细胞Tritonx-100可溶性组分中检测到表达,免疫荧光检测发现EspH分布于细胞膜,基垫形成处;转染实验发现EspH与EGFP融合蛋白分布于细胞膜,且转染的细胞变成球形;感染实验发现:ΔespH删除株能有效诱导基垫形成,其降低Caco-2细胞屏障功能的能力和造成TC-7细胞微绒毛脱落损伤能力与EPEC野生型相似。2、PCR和Western Blot证实:Δmap、ΔespF和Δmap espF等删除株构建成功,MMP检测发现:与EPEC野生型相比,Δmap和ΔespF删除株降低线粒体膜电位功能减弱（P<0.05）,Δmap espF双删除株功能较Δmap或ΔespF进一步减弱（P<0.05）,但Δmap espF功能较T3SS删除株Δcfm-14强大（P<0.05）,而且,删除株缺失功能能被质粒表达相应蛋白互补,并且,定位于细胞质的突变体EspFL16E也能互补删除株的功能。对Δeae和Δtir删除株的检测发现:其降低MMP功能较野生型显著减弱（P<0.05）,Δeae删除株可以被质粒表达intimin互补,但是Δtir不能被质粒表达Tir所互补,但可以被染色体表达野生型Tir和突变TirY474S所互补,而不能被染色体表达突变TirS434A互补;而ΔespG和ΔespH降低MMP能力与野生型比较无显著性差异,但ΔespZ删除株具有比野生型更强大的功能（P<0.05）,Western Blot检测发现:ΔespZ删除株转位的Tir蛋白具有不同的磷酸化修饰迁移条带。3、EPEC野生型感染TC-7细胞,最先细菌呈局限性粘附,菌落呈三维球状,随后可见有大量细菌紧密粘附在细胞表面,菌落致密平坦,并可见大量微绒毛脱落;BFP删除株ΔbfpA感染后只有个别细菌粘附,细胞微绒毛完好;而T3SS删除株Δcfm-14感染细胞以后,虽有大量细菌粘附,但细菌成局限性粘附,且只见微绒毛紊乱,未见微绒毛脱落损伤;外膜蛋白intimin删除株（Δeae）和其受体Tir删除株（Δtir）感染后,可见细菌皆呈局限性粘附,微绒毛大量脱落,但质粒互补表达相应效应分子以后,恢复删除株到野生型相似表型;而用ΔespF或Δmap espF双删除株感染后,有大量细菌粘附,细菌下陷入微绒毛丛,但是微绒毛脱落损伤轻微,质粒表达EspF互补ΔespF删除株后,恢复删除株到野生型相似表型。结论:1、EspH是EPEC毒力岛基因LEE编码的一个依耐T3SS转位的效应分子,转位以后,蛋白分布于细胞膜,基垫形成处,且对转染细胞有一定毒性,但未发现EspH在EPEC基垫形成、屏障功能障碍和微绒毛脱落方面具有重要作用。2、EPEC感染Hela细胞,效应分子Map和EspF可以单独并协同地引起线粒体功能障碍,且EspF作用不依耐其靶向线粒体;intimin、Tir是参与线粒体功能障碍的重要分子,TirS434在Tir功能发挥中起重要作用,EspZ调节Tir的磷酸化修饰,也参与线粒体功能障碍。3、BFP是EPEC感染细菌粘附的重要分子,T3SS是EPEC感染细菌紧密粘附和造成微绒毛脱落损伤的重要结构,intimin和Tir是细菌感染紧密粘附的重要分子,也参与了微绒毛脱落损伤,而EspF是造成微绒毛脱落损伤的主要分子。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 致病性大肠杆菌ΔESPH 的构建及功能探讨
• 1 材料与方法
• 2 实验结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二部分 效应分子在EPEC 致线粒体功能障碍中的作用
• 第一节 MAP、ESPF 在EPEC 致线粒体功能障碍中作用
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 第二节 EPEC 致线粒体功能障碍效应分子筛选
• 1 材料与方法
• 2 实验结果
• 第三节 TIR在线粒体功能下降中的作用
• 1 材料与方法
• 2 实验结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三部分 效应分子在EPEC 感染粘附、脱落损伤中的作用
• 1 材料与方法
• 2 实验结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 附图
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文