激素调控矮牵牛离体再生花瓣的研究

论文摘要

花发育是植物生长发育的关键过程,花的形成和发育一直是人们研究的热点。通过对拟南芥等模式植物的研究,人们总结出了五条开花途径（光周期促进途径、春化促进途径、自主促进途径、GA促进途径和成花抑制途径）和调控花器官形成的ABC模型。在花的形成和发育过程中激素有着重要的调控作用。关于赤霉素对开花的调控作用已有较深入的研究,然而对于细胞分裂素和生长素通过信号转导途径调控花发育的分子机理研究较少。对花叶千年木、风信子、水稻、拟南芥等植物的离体器官再生的研究结果表明,生长素和细胞分裂素参与对花器官发育的调控。本研究以模式植物矮牵牛（Petunia hybrida）为实验材料,建立了激素调控的花瓣离体再生系统。本系统选取单核晚期（花粉时期）的花瓣下部1/3部分为外植体,在施加0.2 mg/L 6-BA和0.8 mg/L IAA的培养基中培养直接再生花瓣获得成功。再生花瓣主要位于外植体的远轴面,有片状花瓣和筒状花冠两种形态;少数位于近轴面,为花瓣突起。花瓣特异表达基因EPF1的启动子驱动GUS表达的分析进一步证实了再生器官为花瓣。形态学观察和组织细胞学分析的结果表明,激素诱导了花瓣再生部位细胞的脱分化。半定量RT-PCR及mRNA原位杂交分析的实验结果表明,激素提高了花瓣决定基因GREEN PETAL（GP）的表达并起始了花分生组织特征基因ABERRANT LEAF AND FLOWER（ALF）的表达。ALF表达的起始标志着花瓣组织细胞脱分化并进入花分生组织状态,并由GP调控重新分化形成花瓣。依据上述结果我们推测,生长素和（或）细胞分裂素可能通过诱导ALF的表达使细胞脱分化进入花分生组织状态,进而通过提高GP的表达水平决定脱分化细胞的分化方向。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 矮牵牛花的组成及发育
• 1.1.1 矮牵牛花的组成特征
• 1.1.2 高等植物花的发育
• 1.1.2.1 花的发生
• 1.1.2.2 矮牵牛花的发育
• 1.1.2.2.1 花器官发育的分子模式
• 1.1.2.2.2 影响花器官分化发育的其它因素
• 1.1.2.2.3 矮牵牛花瓣的发育
• 1.2 激素调控高等植物花发育
• 1.2.1 激素作用概论
• 1.2.2 生长素作用机理
• 1.2.3 细胞分裂素作用机理
• 1.2.4 激素调控细胞周期的作用机制
• 1.3 离体再生系统研究进展
• 1.3.1 风信子花瓣离体再生系统
• 1.3.2 水稻雌蕊离体再生系统
• 1.3.3 拟南芥花序轴离体再生系统
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 酶和生化试剂
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 矮牵牛花瓣的组织培养
• 2.2.2 植物组织普通石蜡切片
• 2.2.2.1 固定
• 2.2.2.2 脱水、透明、浸蜡、包埋
• 2.2.2.3 弗尔根染色-固绿衬染
• 2.2.3 半定量 RT-PCR 分析
• 2.2.3.1 矮牵牛总 RNA 的提取
• 2.2.3.2 甲醛变性胶电泳
• 2.2.3.3 RNA 的纯化
• 2.2.3.4 反转录cDNA第一条链的合成
• 2.2.3.5 半定量 RT-PCR 检测
• 2.2.4 pEPF1::GUS 表达载体的构建
• 2.2.4.1 小量法提取植物基因组
• 2.2.4.2 植物基因组 DNA 的纯化
• 2.2.4.3 PCR 扩增目的片断
• 2.2.4.4 连接反应
• 2.2.4.5 大肠杆菌感受态的制备及转化
• 2.2.4.5.1 大肠杆菌感受态的制备
• 2.2.4.5.2 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.2.4.6 碱法小量提取菌体质粒
• 2.2.4.7 酶切鉴定
• 2.2.4.8 序列测定
• 2.2.5 叶盘法转化矮牵牛
• 2.2.5.1 根癌农杆菌 LBA4404 感受态细胞的制备及转化
• 2.2.5.1.1 LBA4404 感受态细胞的制备
• 2.2.5.1.2 LBA4404 感受态细胞的转化
• 2.2.5.2 农杆菌介导的叶盘转化法
• 2.2.5.2.1 矮牵牛的栽培
• 2.2.5.2.2 矮牵牛叶盘法转化
• 2.2.6 mRNA 原位杂交
• 2.2.6.1 材料的固定
• 2.2.6.2 材料的包埋
• 2.2.6.3 切片
• 2.2.6.4 探针标记
• 2.2.6.5 脱蜡、消化、乙酰化、杂交
• 2.2.6.6 洗片
• 2.2.6.7 检测
• 3 结果与分析
• 3.1 激素诱导矮牵牛离体再生花瓣系统的建立
• 3.1.1 激素浓度变化对再生花瓣频率的影响
• 3.1.2 遗传背景对再生器官种类的影响
• 3.1.3 离体再生花瓣系统的建立
• 3.2 离体再生花瓣的形态学观察
• 3.3 花瓣离体再生过程中的细胞组织学观察
• 3.4 再生花瓣中花瓣Marker基因EPF1的表达
• 3.5 激素调控再生花瓣发育过程中相关基因的表达
• 3.5.1 花器官特征决定基因的表达分析
• 3.5.2 花分生组织决定基因的表达分析
• 3.5.3 苗端分生组织决定基因的表达分析
• 3.5.4 细胞周期相关基因的表达分析
• 4 讨论
• 4.1 外植体的种类对再生器官类型和频率的影响
• 4.2 花瓣外植体的年龄和部位对再生频率的影响
• 4.3 遗传背景对再生的器官种类及形态的影响
• 4.4 再生花瓣的形态与频率与其着生部位的关系
• 4.5 激素对再生花瓣中细胞状态的影响
• 4.6 激素对花瓣特征决定基因和花分生组织特征决定基因的调控
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢