论文摘要
晚期卵巢粘液性癌使用经典TP（泰素类+铂类）方案化疗的有效率明显低于其它类型卵巢上皮性癌,5年存活率仅为30～40%。分泌粘液是这一病理类型卵巢癌的特点,这些粘液是否会影响化疗药物的作用,粘液分解酶的使用能否提高化疗疗效,对这些问题,目前尚无相关研究。本研究通过查阅文献分析筛选,以Endo-α-N-acetylgalactosaminidase（Endo-α-N-乙酰半乳糖转移酶）作为粘液分解酶,结合体内外实验评价粘液分解前后泰素化疗作用的差异,以期探索卵巢粘液性癌的新的联合治疗方法。课题分为以下三个部分进行研究:第一部分人卵巢粘液性癌粘液的分布及其所含粘蛋白类型的鉴定目的:研究卵巢粘液性癌细胞株OMC685所分泌粘液在细胞和组织的分布,并鉴定该粘液中所含粘蛋白（mucin）的类型。方法:1.培养卵巢粘液性癌细胞株OMC685,待细胞密度长至70%从形态学（光镜、扫描电镜、透射电镜）观察卵巢粘液性癌细胞及其表面粘液分布;OMC685细胞贴壁后培养48 h、72 h,密度分别长至30%、70%,行阿尔辛蓝—过碘酸雪夫（AB-PAS）染色,光镜下观察细胞粘液分布;2.用OMC685制成裸小鼠皮下瘤,行HE与AB-PAS粘液特殊染色,光镜下观察卵巢粘液性癌组织表面粘液分布;3.将OMC685制成细胞爬片,使用分泌性粘蛋白mucin 2、mucin 5AC、mucin 5B及mucin 6单克隆抗体行免疫细胞化学检测,鉴定该分泌性粘蛋白的类型;4.培养至对数生长期的OMC685重悬于培养液,以30%的密度接种,贴壁后换无血清无酚红培养液,培养24、48、72h分别提取培养液,ELISA法检测其中mucin2含量。结果:1.光学显微镜下见卵巢粘液性癌细胞株OMC685细胞大小不一,以多边形为主,少数瘤巨细胞及多核细胞点缀其中,分裂相多见。透射电子显微镜下见瘤细胞为卵圆形或多边形,细胞间细胞连接多为紧密连接;细胞表面见微绒毛;核大,核质比高,染色质分布不均;较多细胞内可见的核糖体板层复合体,具有腺上皮恶性肿瘤细胞的特征;扫描电镜见细胞表面多微绒毛,表面分布网状物质;OMC685表面分布蓝染（酸性）或紫红染（中性）粘液,随培养时间延长,细胞周围粘液增多,同法处理卵巢浆液性癌细胞株SKOV3,表面无特异染色粘液分布;2.OMC685裸鼠皮下瘤HE染色见细胞形态学特点同培养细胞,AB-PAS染色见瘤结节周围环绕蓝染合并紫红染粘液层,细胞间隙可见小片状紫红染中性粘液池,提示体内卵巢粘液性癌组织表面覆盖有粘液层:3.OMC685免疫细胞化学染色显示粘蛋白mucin 2阳性,mugin 5AC,mucin 5B及mucin 6阴性,与之对照卵巢浆液性癌细胞株CaoV3上述四种粘蛋白均为阴性,提示卵巢粘液性癌较为特异地分泌mumin 2;4.与空白无血清无酚红培养液对比,24、48、72h培养液均为阳性,其中48h时（细胞长至对数生长期）mucin 2含量达峰值。结论:证实卵巢粘液性癌细胞OMC685表面分布有粘液层,裸鼠皮下移植瘤组织表面亦覆盖有粘液层,通过免疫细胞化学、ELISA法确认该粘液成分主要为mucin2,并且在细胞培养48 h时（细胞长至对数生长期）分泌达峰值。第二部分筛选卵巢粘液性癌粘液分解酶并观察其分解肿瘤细胞周围粘液的作用目的:筛选出较为特异的卵巢粘液性癌粘液分解酶,并确认该酶的分解效果。方法:1.粘液的主要成分为粘蛋白,是一种大分子量糖蛋白,以较高特异性、适宜细胞生长环境使用的原则,通过查阅文献筛选出适宜的粘液分解酶;2.培养细胞长至对数生长期,吸净培养液,取不稀释、1:10、1:100、1:1000、1:10000稀释五个浓度的粘液分解酶Endo-α-N-acetylgalactosaminidase覆盖细胞,5%CO2 37℃细胞培养箱中孵育3 h后倒置显微镜下观察细胞生长状态;在前述实验结果的基础上再取1:200、1:400、1:800三个稀释倍数的酶反应液加入细胞培养板,方法同上,37℃细胞培养箱中孵育3 h后倒置显微镜下观察细胞生长状态;3.培养至对数生长期的OMC685重悬于培养液,以1×105个/ml的密度接种,贴壁后换无血清无酚红培养液,培养24、48、72 h分别提取培养液,其中取部分48 h培养液以200:1的比例加入Endo-α-N-acetylgalactosaminidase,37℃培养箱中孵3 h,ELISA检测细胞培养液中mucin 2的含量;4.OMC685细胞爬片长至30%,70%,用1:200稀释的Endo-α-N-acetylgalactosaminidase反应液在37℃培养箱中孵育3 h,AB-PAS染色光镜下观察细胞表面粘液的分解,扫描电镜观察细胞表面结构的变化。结果:1.根据文献,Endo-α-N-acetylgalactosaminidase能够较特异地作用于粘蛋白的糖苷键,分解粘液;2.Endo-α-N-acetylgalactosaminidase能够作用于细胞生长环境,以1:200稀释度用于体外实验可达到作用于细胞的有效工作浓度:3.ELISA法检测结果提示,使用Endo-α-N-acety]galactosaminidase后48 h培养液中mucin 2含量降低,与使用该酶前mucin 2的含量相比差异有显著性,证明Endo-α-N-acetylgalactosaminidase对粘液的分解是有效的;4.OMC685细胞爬片AB-PAS染色提示细胞长至70%表面粘液多于细胞密度30%,Endo-α-N-acetylgalactosaminidase作用后细胞表面粘液层基本消失,细胞突起回缩。扫描电镜观察到细胞表面网状结构减少,细胞表面微绒毛粗而短,细胞贴壁状态未改变。结论:Endo-α-N-acetylgalactosaminidase可以较有效地分解细胞表面粘液层,孵育后培养液中mucin 2含量降低,可以用于进一步实验,借以观察对泰素化疗的影响。第三部分体内外实验验证粘液分解对泰素作用于卵巢粘液性癌的影响目的:研究粘液分解对泰素治疗卵巢粘液性癌效果的影响。方法:1.在体外实验中,以MTT法检测不同浓度泰素对OMC685的杀伤作用,选取泰素作用于OMC685的有效工作浓度;2.取不同浓度泰素分别作用于SKOV3与CaoV3,选择本部分体外实验的对照细胞系;3.消化对数生长期OMC685制成细胞悬液,以0.5×105/ml接种于96孔板,分对照组、加酶组、加泰素组、酶加泰素组共四组,每组取3复孔,待细胞贴壁后继续培养24 h,加酶组与酶加泰素组吸净细胞培养液,每孔加入1:200稀释的酶反应液,37℃培养箱孵育3 h后吸除酶反应液,加泰素组与酶加泰素组再加入0.1μmol/L含泰素培养液,24、48、72 h后MTT法检测活细胞量,Brdu法检测OMC685的增殖程度;4.消化对数生长期SKOV3制成细胞悬液,以1×106/ml接种于96孔板,分为对照组、加粘液组、加泰素组、粘液加泰素组共四组,细胞贴壁后同时提取培养OMC685达48h的含粘液培养液覆盖于加粘液组和粘液加泰素组SKOV3表面,加泰素组和粘液加泰素组再予含泰素培养液覆盖于其上,各组细胞培养液中泰素终浓度均为0.1μmol/L,24、48、72h后MTT法检测活细胞量,Brdu法检测细胞增殖;5.在体内实验中,首先需初步探索体内使用Endo-α-N-acetylgalactosaminidase辅助泰素治疗的工作浓度,裸小鼠皮下接种OMC685,四周后皮下瘤长至直径约1cm取出,修剪成直径3mm的近圆形小瘤块缝于裸小鼠大网膜表面,分为泰素组、1:200稀释酶加泰素组、1:40稀释酶加泰素组,生理盐水组作为对照组,每组3只。接种3天后隔天给药,生理盐水组腹腔注射0.2ml生理盐水,泰素组每次腹腔注射0.2 ml 1mg/ml泰素,酶加泰素组先予相应稀释浓度酶每只0.2ml腹腔注射,3 h后再予1mg/ml泰素0.2ml腹腔注射,共给药4次。停药3天后检测肿瘤大小及各脏器的肿瘤转移情况;6.根据前述实验结果选择1:200稀释酶反应液作为体内实验分解酶的工作浓度,同前法制作裸小鼠网膜移植瘤模型,分为三组:生理盐水组、泰素组、1:200稀释酶加泰素组,每组10只,给药方法同前,停药一周后牺牲裸小鼠,检测肿瘤大小、重量,观察腹腔及各脏器肿瘤转移情况。结果:1.在体外作用于0MC685 0.1μmol/L泰素能达到有效治疗效果;2.不同泰素浓度组与单细胞对照组相比对CaoV3的抑制率差异无显著性,说明该细胞株可能为泰素耐药株;泰素作用于SKOV3在浓度达0.1、1μmol/L时活细胞量与对照组相比差异有显著性,该两组问差异无显著性,故选择SKOV3作为体外实验对照细胞系,0.1μmol/L作为其有效工作浓度;3.Endo-α-N-acetylgalactosaminidase孵育3h后使用泰素,24、48、72h行MTT法及Brdu法检测,酶加泰素组与单用泰素组相比对OMC685的抑制率均明显增加,并随时间增加差异显著性增加;4.SKOV3覆盖粘液培养液后使用泰素治疗,MTT及Brdu检测均提示对SKOV3的抑制率弱于单用泰素,48、72 h组差异有显著性;5.筛选酶浓度的体内实验中,网膜移植的裸小鼠93.3%成瘤,生理盐水对照组网膜移植瘤体积46.09±5.9 mm3,泰素组网膜移植瘤体积13.57±1.26 mm3,1:200稀释度酶加泰素组网膜移植瘤体积9.21±1.2 mm3,1:40稀释度酶加泰素组网膜移植瘤体积7.7±0.66 mm3,从结果中可以看出1:200稀释酶加泰素组与1:40稀释酶加泰素组相差不大,故选择1:200稀释度作为体内实验的工作浓度;6.选择1:200稀释度作为分解酶有效工作浓度,给药方法同前,给药两周后牺牲裸小鼠,单用生理盐水组网膜移植瘤体积111.62±31.05mm3,单用泰素组网膜瘤体积61.04±12.59mm3,1:200酶加泰素组网膜瘤体积34.76±5.46mm3;生理盐水组与泰素组差异有显著性（P＜0.01）,泰素组与酶加泰素组差异有显著性（P＜0.01）:泰素组抑瘤率达37.38%,1:200稀释度酶加泰素组抑瘤率达53.46%;说明1:200稀释度酶辅助泰素用药对OMC685的抑瘤率高于单用泰素。各组均未见其它器官有瘤结节形成。结论:体外体内实验均提示分解酶辅助泰素化疗可以增强泰素作用的效果。总结:人卵巢粘液性癌表面分布有粘液层,Endo-α-N-acetylgalactosaminidase可对其有效分解,这一分解能够辅助提高泰素治疗的抑瘤率。