论文摘要
痛经是指育龄期女性在月经前后及行经期间,下腹及腰部痉挛性疼痛,严重时伴有头痛、恶心、呕吐、肢冷等症状。痛经分为原发性痛经和继发性痛经两种类型,原发性痛经,多在初潮开始后6个月内发生,无明显生殖系统病变。继发性痛经,由生殖器炎症、子宫肌瘤、子宫内膜异位等明确生殖系器质性统病变引发。原发性痛经是目前妇科最常见疾病,严重影响妇女的正常工作和生活质量。其发病因素复杂,病理改变主要为子宫平滑肌和子宫壁螺旋动脉强烈收缩、缺血和缺氧。现代医学普遍认为痛经主要与以下几方面因素关系密切。一、前列腺素（prostaglandin,PGs）的改变被认为是形成痛经的根本机制。有研究表明,子宫肌细胞不仅是PGs的靶细胞,其自身亦可在激素和某些介质的特定作用下,产生各种不同的PGs物质,参与调节子宫肌细胞的收缩和舒张。在PGs家族中,PGE2是重要的致炎致痛的炎症介质,能产生广泛而持久的血管扩张作用和致痛作用,与痛觉过敏有关。痛经患者子宫内膜中PGs含量显著高于正常妇女高。无论是增生期或分泌期的子宫内膜都有PGE2。研究表明,身患痛经的女性体内PGE2水平较高。当PGE2的水平升高时疼痛加剧,并且伴发一系列临床症状:剧烈腹痛、恶心、呕吐、低血压、面色苍白、腹泻或便秘、昏晕、轻微头痛、疲劳健忘等。二、痛经与月经周期中性激素水平变化相关。黄体中期雌激素高峰促进月经前期子宫内膜PGs生成增加,痛经模型大鼠的外周血、子宫中PGs的含量与雌二醇（estrogen 2,E2）浓度密切相关。三、痛经的发生与β-内啡肽（β-EP）密切相关。β-EP是一类具有吗啡样活性的神经多肽,具有内源性镇痛作用,参与生殖内分泌的调节,在调控下丘脑-垂体的功能方面起重要作用。β-EP受性激素制约,孕酮能显著提高β-EP的分泌,而雌二醇却抑制孕酮对β-EP的作用。因此,黄体期β-EP水平的降低导致子宫功能活动失常,被认为是痛经发生的原因之一。流行病学研究表明原发性痛经是目前妇科最常见疾病,据国内抽样调查表明,我国妇女中痛经发生率为33.1%,其中原发性者占53.2%,痛经严重影响工作者占13.55%。加拿大的学者研究发现60%的妇女有中到重度原发性痛经,其中51%的痛经妇女日常生活受到影响,17%的重度痛经患者因痛经而不得不缺工或缺课。在马来西亚,一项针对12-19岁中学女生的最新流行病学调查研究显示,约有69.4%的被调查女生经历过原发性痛经。因此,重视痛经的治疗十分必要。非甾体类抗炎药（non-steroidal anti-inflammatory drug,NSAIDs）是临床治疗原发性痛经最常用药物,约有64%～100%患者应用此类药物后主观症状减轻。NSAIDs可通过抑制环氧化酶-2（Cycloxygenase-2,COX-2）而减少PGs的生物合成,缓解由PGs引起的子宫痉挛性收缩,与其他镇痉止痛药联合运用可增强止痛效果。COX有COX-1和COX-2两种同功酶,传统的NSAIDs类药物对两种酶的选择性较差,因而易引起胃肠道和中枢神经系统等一系列副作用,如甲氯灭酸、芬必得、硫酸扑热息痛、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、消炎痛等,有效率30%～80%,但引起胃肠道和中枢神经系统的副作用较多。20世纪90年代中、后期,COX-2选择性抑制剂如美洛昔康、MK966等新一代NSAIDs相继开发上市,虽然降低了胃肠道副作用,但由于其价格昂贵及尚存的副作用,影响了其普及应用。帕瑞昔布为高选择性COX-2抑制剂,静脉注射后可迅速被肝脏羧酸酯酶水解成伐地昔布[4-（5-甲基-3-苯异唑-4-yl）苯磺酰胺],伐地昔布是高选择性COX-2抑制剂,参与前PGs合成过程,通过特异性抑制COX-2阻断花生四烯酸合成PGs而发挥抗炎镇痛作用。大量临床研究表明,帕瑞昔布在妇科、骨科、普外科,神经外科等多种手术术后镇痛中起到了良好的镇痛效果,不仅不良反应少,而且可以减少阿片类药物的用量。目前帕瑞昔布的应用已不仅限于手术后疼痛的治疗,临床实验证明,手术前超前使用帕瑞昔布可以明显降低术后疼痛的VAS评分,提高患者的满意率,并减少术后其他麻醉性镇痛药的用量。目前国内外对原发性痛经的治疗研究多与传统NSAIDs相关,本实验结合帕瑞昔布钠的药理学特点及优点,探索其对原发性痛经可能的作用机制。在临床工作中,许多处于黄体末期的原发性痛经患者需要经历手术,因此,提前干预手术前期处于黄体末期的原发性痛经患者是否具有现实意义?本研究采用催产素和苯甲酸雌二醇制作大鼠痛经模型,原理是:雌激素可提高子宫肌肉对催产素的敏感性,催产素引起雌性大鼠的子宫肌性收缩,从而产生"痛性痉挛"。大鼠注射催产素后,出现腹部收缩,躯干与后肢伸展,以及臀部与一侧肢体内旋的"歪扭"反应。催产素所致痛经模型具有造模方法简单、重复性较好等特点,在我国很大一部分的痛经研究选用催产素所致痛经模型,故本实验选用之。并通过此模型,研究非甾体类抗炎药帕瑞昔布钠对原发性痛经大鼠的作用,并观察帕瑞昔布钠对此模型的痛阈、血清炎症因子、子宫内膜、大脑扣带回、额叶皮质等组织COX-2、PGE2、β-EP的影响,为临床应用帕瑞昔布钠治疗原发性痛经提供实验依据。材料与方法1、实验动物Wistar雌性未孕大鼠48只,体重180-200克,由南方医科大学实验动物中心提供。饲养条件:普通级动物实验房,大鼠每笼5只,饲养2天后启用,由专人饲养管理。动物室灯光12小时照明,通风和空调设备良好,室温控制在25士 1℃,相对湿度为40-50%。实验室按常规定期消毒。2、动物分组及处理因素Wistar大鼠随机分成4组,每组12只,分组和处理因素分别为:①C组:空白对照组② M组:原发性痛经模型组③A组:原发性痛经模型+术前30分钟帕瑞昔布钠超前镇痛组④B组:原发性痛经模型+术前连续3天帕瑞昔布钠超前镇痛组3、原发性痛经大鼠模型建立参照《常用医药研究动物模型》大鼠原发性痛经模型制作方法建立模型,或取Wistar雌性未孕大鼠,体重180-200g,连续10天给大鼠皮下注射雌二醇（第1、10两天皮下给0.5mg/只/日,其余为0.2mg/只/日）,再间隔45分钟后腹腔注入催产素2u/只,观察30min内的扭体反应次数M组:连续10天给大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇（第1、10两天皮下给0.5mg/只/日,其余为0.2mg/只/日）。A组:连续10天给大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇（第1、10两天皮下给0.5mg/只/日,其余为0.2mg/只/日）,第十一天腹腔注入用催产素2u/只,观察30min内的扭体反应次数,并于术前30分钟给予帕瑞昔布钠0.72mg/kg。B组:连续10天给大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇（第1、10两天皮下给0.5mg/只/日,其余为0.2mg/只/日）,第十一天腹腔注入用催产素2u/只,观察30min内的扭体反应次数,并于术前3天给予帕瑞昔布钠0.72mg/kg。4、大鼠痛阈测定1)采用华东师范大学科教仪器厂型号为EP601C直流电钾离子透入痛阈测试仪测定,实验前先在大鼠测痛部位周围涂以导电膏,并加以摩擦,使皮肤电阻阻值降低,增加电流在皮肤的渗透性。2)取黑色无关电极（负极）,按电极的大小裁剪纱布,于饱和氯化钾溶液浸湿,将此纱布缚在被试的大鼠尾巴根部上部,再将无关电极隔着纱布裹扎在大鼠左腿上。3)取红色有效电极（正极）,取氯化钾饱和溶液注入孔内,使棉花浸湿。4)主试将有效电极的塞有棉花一端放在被试大鼠的测痛部位上。5)被试大鼠出现甩尾反射时,记录该时电流毫安数,作为痛阈。6)测痛三次,每次间歇5分钟,取其平均值5、计算大鼠扭体次数造模第10天给予苯甲酸雌二醇后,间隔lh,每只大鼠腹腔注射催产素2U/只,大鼠注射催产素后,出现腹部收缩,躯干与后肢伸展以及臀部与一侧肢体内旋的"歪扭"反应,观察30min内各组大鼠的平均扭体次数。6、盲肠切除术大鼠实验前晚禁食12h,正常饮水,次日上午称重,20%乌拉坦（5 ml/kg）腹腔注射麻醉后,将大鼠仰卧固定于鼠板上,利用保温灯使大鼠体温控制于（35±1）℃。手术步骤:大鼠腹部备皮→消毒→铺无菌手术巾→无菌条件下沿腹中线切开皮肤、肌肉和腹膜→找到盲肠组织→分离并结扎盲肠与小肠之间的血管→切除盲肠→分层缝合腹膜、肌肉以及皮肤。7、血浆 E2、TNF-α、IL-1、IL-10、β-EP 浓度测定所有血液样本离心后留取血浆,液氮-80℃C条件下保存,用于测定血浆中TNF-α、IL-1、IL-10、β-EP含量。试剂盒采用的是生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法测定样品中大鼠血浆E2、TNF-α、IL-1、IL-10、β-EP的浓度。分别向预先包被了大鼠E2、TNF-α、IL-1、IL-10、β-EP单克隆抗体的酶标孔中加入E2、TNF-α、IL-1、IL-10、β-EP,温育;温育后,分别加入生物素标记的抗E2、TNF-α、IL-1、IL-10、β-EP抗体,再与链霉亲和素-HRP结合,形成免疫复合物,经过温育和彻底洗涤后加入底物TMB显色。TMB在过氧化物的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。待测标本浓度越高,标记抗原和抗体的结合就越受抑制,显色越浅。显色的深浅与酶量呈正相关,而与样品中待测物质含量呈负相关。用酶标仪在450nm波长下测吸光度（OD值）,计算样品浓度。8、免疫组化方法检测子宫组织内COX-2、PGE2的表达（1）脱水与透明（2）浸蜡、包埋、修腊块（3）脱蜡和水化（4）对组织抗原进行相应的修复（5）阻断内源性过氧化物酶（6）每张切片加50ul的非免疫性动物血清,室温下孵育10分钟（7）去血清,每张切片加50ul的第一抗体,4℃过夜（8）PBS冲洗3min ×3次,每张切片50ul生物素标记的第二抗体,室温下孵育10分钟,PBS冲洗3min ×3次（9）每张切片加50ul链霉菌抗生物素一过氧化物酶溶液,室温下孵育10分钟,PBS冲洗3min ×3次（10）每张切片加100ul新鲜配制的DAB,显微镜下观察3-10分钟,终止显色（11）梯度酒精脱水之后,封片,拍照9、Western-blot法检测扣带回、前额叶皮质组织内COX-2、PGE2、β-EP的定量表达从低温冰箱中取出相应大鼠的脑组织,每个称取50mg,剪碎放入研钵里,用液氮研磨碎,将组织裂解液转入EP管内,提取的脑组织总蛋白。根据样品数量配制BCA工作液。稀释蛋白样品,按说明书加标准品及样品至96孔板中,以A562测定,根据标准曲线计算出蛋白浓度。SDS—聚丙烯酸胺凝胶电泳,转膜,将PVDF膜作好记号封闭,4℃C过夜。加一抗与抗原结合,然后加二抗与一抗的结合,最后将两种显色液A、B液按1:1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀,在暗室中将X光片覆盖在膜的上面15min,显影。10、统计学处理采用完全随机分组设计资料,大鼠痛阈采用重复测量数据的方差分析,组内效应比较、组间效应比较、交互效应比较、多重比较有显著差异,若方差齐则采用LSD检验;若方差不齐,采用Dunnett T3检验。其他数据用均数±标准差（x±s）表示,用统计软件SPSS13.0处理,用One Way ANOVA单因素分析,组间比较有显著性差异,若方差齐则采用LSD检验;若方差不齐,采用Welch F检验,再采用Dunnett T3检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果1、大鼠痛阈Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差齐（F=1.323,P=0.112）;组间效应比较:帕瑞昔布钠对大鼠痛阈影响的差异有显著差异（F=10.090,P<0.01）;组内因素4个不同水平间差异有统计学意义（F=27.854,P<0.01）,痛阈与处理因素有交互作用（F=8.277,P<0.01）。与C组比较,M组与A组痛阈均降低,差异显著（P<0.01）,B组和C组痛阈差异无统计学意义（P=0.137）;与M组比较,B组痛阈降低,差异有统计学意义（P=0.002）,A组和M组痛阈差异不显著（P=0.534）;与A组比较,B组痛阈降低,差异有统计学意义（P=0.011）。2、大鼠扭体次数Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差不齐（F=16.491,P<0.01）,采用Kruskal-Wallis检验方法,四组之间差异有显著性意义（F=38.791,P<0.01）,帕瑞昔布钠对原发性痛经大鼠的扭体次数影响有显著意义。根据平均秩次可推断,空白对照组扭体次数最少,模型组最多,术前提前3天使用帕瑞昔布钠组效果最好,术前提前30分钟使用帕瑞昔布钠组次之。3、大鼠血浆E2水平Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差齐（F=1.424,P=0.249）,组间比较差异有统计学意义（F=3.117,P=0.036）。M组、A组和B组血浆E2浓度均高于C组（P<0.05）;A组和B组血浆血浆E2浓度与M组比较,差异均不显著（P=0.858,P=0.892）;与A组比较,B组血浆E2浓度差异不显著（P=0.754）。4、子宫内膜COX-2表达Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差不齐（F=9.971,P<0.01）,组间比较差异有统计学意义（F=86.744,P<0.01）。M组、A组、B组大鼠子宫内膜COX-2表达均比C组表达增加,差异显著（P<0.01）;A组、B组子宫内膜COX-2表达均较M组降低,差异显著（P<0.05,）;与A组比较,B组子宫内膜COX-2表达降低,差异显著（P<0.05）。5、子宫内膜PGE2表达Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差不齐（F=4.268,P=0.01）,组间比较差异有统计学意义（F=82.519,P<0.01）。M组、A组和B组大鼠子宫内膜PGE2表达均比C组表达增加,差异显著（P<0.01）;与M组比较,A组子宫内膜PGE2表达降低不显著（P=0.071）,B组表达显著降低（P<0.01）;与A组比较,B组子宫内膜PGE2表达显著降低（P<0.05）。6、血浆TNF-α浓度Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差不齐（F=8.965,P<0.01）,组间比较差异有统计学意义（F=21.038,P<0.01）。M组、A组和B组血浆TNF-α浓度均高于C组,差异显著（P<0.01）;与M组比较,B组血浆TNF-α浓度显著降低（P<0.05）,A组差异不显著（P=0.088）;与A组比较,B组差异无统计学意义（P=0.932）。7、血浆IL-1浓度Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差不齐（F=7.601,P<0.01）,组间比较差异有统计学意义（F=29.345,P<0.01）。M组、A组和B组血浆IL-1浓度均高于C组,差异显著（P<0.05）;A组和B组血浆IL-1浓度均低于M组,差异有统计学意义（P<0.05）;与A组比较,B组血浆IL-1浓度降低,差异有统计学意义（P<0.05）。8、血浆IL-6浓度Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差不齐（F=3.011,P=0.04）,组间比较差异有统计学意义（F=14.767,P<0.01）。M组、A组和B组血浆IL-6浓度均高于C组,差异显著（P<0.05）;A组、B组血浆IL-6浓度均低于M组,差异有统计学意义（P=<0.05）;与A组比较,B组血浆IL-6浓度差异不显著（P=0.999）。9、血浆β-EP浓度Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差齐（F=2.088,P=0.116）,组间比较差异不显著（F=2.711,P=0.056）。M组血浆β-EP浓度低于C组,差异显著（P<0.05）,A组和B组与C组比较,差异均无统计学意义（P=0.283,P=0.911）;与M组比较,B组血浆β-EP浓度显著增高（P<0.05）,A组差异不显著（P=0.20）;与A组比较,B组血浆β-EP浓度差异不显著（P=0.237）。10、前扣带回COX-2表达Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差齐（F=0.202,P=0.892）,组间比较差异有统计学意义（F=41.486,P<0.01）。M组、A组和B组大鼠前扣带回COX-2表达高于C组,差异显著（P<0.01）;A组和B组前扣带回COX-2表达低于M组,差异显著（P<0.05,P<0.01）;与A组比较,B组前扣带回COX-2表达不显著（P=0.068）。11、海马COX-2表达Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差齐（F=0.564,P=0.654）,组间比较差异有统计学意义（F=195.048,P<0.01）。M组、A组和、B组大鼠海马COX-2表达高于C组,差异显著（P<0.01）;A组、B组海马COX-2表达低于M组,差异显著（P<0.05）;与A组比较,B组前扣带回COX-2表达不显著（P=0.864）。12、额叶皮质COX-2表达Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差不齐（F=2.118,P=0.176）,组间比较差异有统计学意义（F=50.369,P<0.01）。M组、A组和B组大鼠额叶皮质COX-2表达高于C组（P<0.01）;A组、B组额叶皮质COX-2表达低于M组,差异显著（P<0.05,P<0.01）;与A组比较,B组额叶皮质COX-2表达降低,差异显著（P<0.05）。13、脊髓COX-2表达Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差齐（F=3.846,P=0.057）,组间比较差异有统计学意义（F=37.556,P<0.01）。M组、A组和B组大鼠脊髓COX-2表达高于C组,差异显著（P<0.01）;A组、B组脊髓COX-2表达低于M组,差异显著（P<0.05,P<0.01）;与A组比较,B组脊髓COX-2表达降低,差异显著（P<0.05）。14、前扣带回PGE2表达Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差不齐（F=4.617,P=0.037）,组间比较差异有统计学意义（F=90.281,P<0.01）。M组、A组和B组大鼠前扣带回PGE2表达均高于C组（P<0.01,P<0.05）;,A组、B组前扣带回PGE2表达均低于M组,差异显著（P<0.05）;与A组比较,B组表达不显著（P=0.872）。15、海马PGE2表达Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差齐（F=3.45,P=0.072）,组间比较差异有统计学意义（F=38.274,P<0.01）。M组、A组和B组大鼠海马PGE2表达均高于C组（P<0.01）;A组、B组海马PGE2表达均低于M组,差异显著（P<0.05,P<0.01）;与A组比较,B组差异不显著（P=0.06）。16、额叶皮质PGE2表达Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差齐（F=0.161,P=0.920）,组间差异有统计学意义（F=218.544,P<0.01）。M组、A组和B组大鼠额叶皮质PGE2表达均高于C组（P<0.01）;A组、B组额叶皮质PGE2表达均低于M组,差异显著（P<0.05,P<0.01）;与A组比较,B组额叶皮质PGE2表达降低,差异显著（P<0.05）。17、脊髓PGE2表达Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差齐（F=4.456,P=0.04）,组间比较差异有统计学意义（F=65.719,P<0.01）。M组、A组和B组大鼠脊髓PGE2表达均高于C组（P<0.05）;与M组比较,A组脊髓PGE2表达差异不显著（P=0.152）,B组脊髓PGE2表达降低,差异显著（P<0.05）;与A组比较,B组脊髓PGE2表达差异不显著（P=0.219）。18、前扣带回β-EP表达Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差齐（F=2.862,P=0.104）,组间比较差异有统计学意义（F=59.638,P<0.01）。M组、A组和B组大鼠前扣带回β-EP表达低于C组,差异显著（P<0.01,P<0.01,P<0.05）;A组、B组前扣带回β-EP表达高于M组,差异显著（P<0.01）;与A组比较,B组前扣带回β-EP表达显著增加（P<0.05）。19、海马β-EP表达Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差齐（F=3.567,P=0.067）,组间差异有统计学意义（F=53.121,P<0.01）。M组、A组和B组大鼠海马β-EP表达低于C组,差异显著（P<0.01,P<0.01,P<0.05）;A组、B组海马β-EP表达高于M组,差异显著（P<0.01）;与A组比较,B组大鼠海马β-EP表达显著增高（P<0.05）。20、额叶皮质β-EP表达Levene检验方差齐性,方方差齐性检验结果提示方差齐（F=2.523,P=0.131）,组间差异有统计学意义（F=24.707,P<0.01）。M组、A组和B组大鼠额叶皮质β-EP表达低于C组,差异显著（P<0.01,P<0.01,P<0.05）;A组、B组额叶皮质β-EP表达显高于M组,差异显著（P<0.05,P<0.01）;与A组比较,B组额叶皮质β-EP表达显著增高（P<0.05）。21、脊髓β-EP表达Levene检验方差齐性,方差齐性检验结果提示方差齐（F=1.809,P=0.224）,组间差异有统计学意义（F=23.263,P<0.01）。M组、A组和B组大鼠脊髓β-EP表达低于C组,差异显著（P<0.01,P<0.01,P<0.05）;A组、B组脊髓β-EP表达高于M组,差异显著（P<0.05,P<0.01）;与A组比较,B组脊髓β-EP表达不显著（P=0.067）。结论1、制作原发性痛经大鼠模型成功。2、原发性痛经大鼠痛阈下降。3、帕瑞昔布钠能提高原发性痛经大鼠痛阈。4、帕瑞昔布钠能显著降低COX-2和PGE2在原发性痛经大鼠子宫内膜的表达。5、帕瑞昔布钠能降低TNF-α、IL-1、IL-6在原发性痛经大鼠外周血液的水平,并增加β-EP在外周血的含量。6、帕瑞昔布钠能降低COX-2、PGE2在原发性痛经大鼠脑组织前扣带回、额叶皮质、海马、脊髓的表达,并增加β-EP在原发性痛经大鼠脑组织前扣带回、额叶皮质、海马、脊髓的表达。