离子液体介质中微生物细胞催化不对称羰基还原反应的研究

论文摘要

近年来,随着对不同光学异构体药理作用研究的进展及对消旋药物申报和使用的限制,手性药物的研究和开发已经成为国际新药研究的热点。许多研究者都在致力于研究和开发转化率高、手性选择性好的手性化合物合成路线,其中生物转化法由于其温和的反应条件及高度的手性选择性而受到人们的青睐。离子液体（ILs）是一种有望用于替代传统挥发性有机溶剂的新型绿色溶剂。本文研究了水/ILs两相体系中微生物细胞不对称还原羰基酯化合物。考察了多种ILs对出芽短梗霉Aureobasidium pullulans CGMCC 1244和葡萄汁酵母Saccharoinyces uvarum SW-58细胞的活性影响,其中[bmim][PF6]对两种细胞均有很好的生物相容性,对细胞的代谢活性影响较小。在水/ILs两相体系中用出芽短梗霉细胞催化4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）制备（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（CHBE）的反应中,[bmim][PF6]是组成水/ILs两相体系的最适非水相,两相体系中可获得较高的摩尔转化率、光学纯度和产物的浓度。通过考察各种影响因素如相体积比、振摇速度、底物初始浓度、最佳温度以及pH发现,这些因素对反应的摩尔转化率和反应初速度有明显影响,但对产物的光学纯度的影响很小。经过条件优化后,产物浓度可以达到47.1 g/L,摩尔转化率可以达到95.6%,光学纯度大于98%ee。对细胞固定化的反复利用研究,发现结果并不理想,相比游离细胞,转化能力有较大下降,而光学纯度变化不大。可能固定化细胞后极大地影响其底物和产物的传质速率,同时导致还原酶和脱氢酶活下降,影响了辅酶再生循环。在水/ILs两相体系中用葡萄汁酵母Saccharoinyces uvarum SW-58细胞催化还原4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯（TFAAE）生成（R）-4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯（（R）-TFHBE）的反应中,[bmim][PF6]是组成水/ILs两相体系的最适非水相,在优化条件下,摩尔转化率和产物的光学纯度分别可达85.8%和89.3%ee。通过底物的流加,可以有效的解除底物抑制和产物积累产物,产物浓度可达41.3 g/L。反应过程中的ee值普遍表现不高,为了进一步提高产物的光学纯度,对产物进行重结晶,得到较高数值,达到95.4%ee。通过对水/[bmim][PF6]反应体系中用葡萄汁酵母Saccharoinyces uvarum SW-58细胞催化还原4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯（TFAAE）生成（R）-4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯（（R）-TFH BE）的反应放大100倍后,研究发现产物的摩尔转化率及光学纯度与摇瓶中相比略有下降,通过缓慢流加底物可以很好的解除底物抑制,同上有效地实现产物的积累,最终产物的摩尔转化率为65.0%,光学纯度为79.4%ee,产物浓度为32.7g/L。通过研究了产品的分离提取工艺,采用异丙醇从ILs中萃取产物,旋转蒸异丙醇发得到粗产品,再经过减压蒸馏,所得到的产品纯度为89.7%,收率达到77.9%。经过产物重结晶,光学纯度有大幅度的提高,为97.7%ee。对ILs的回收作了初步研究,发现ILs可以通过一种较简单的工艺达到回收的目的,有效回收收率达90%以上。

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第一章绪论

1.1 手性与不对称还原

1.1.1 手性和手性的意义

1.1.2 不对称合成制备手性化合物

1.2 生物催化羰基不对称还原的机理

1.2.1 酶催化和全细胞催化的比较

1.2.2 微生物催化羰基的不对称还原

1.2.3 氢供体与辅酶再生

1.3 非水相中的生物催化

1.3.1 非水相酶催化

1.3.2 有机介质中微生物整细胞催化

1.4 离子液体中的生物催化

1.4.1 概述

1.4.2 离子液体在生物催化中的应用

1.4.3 离子液体中微生物不对称还原羰基化合物

1.5 本文的研究意义与研究内容

第二章离子液体对细胞活性的影响

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 离子液体对细胞生长活性的影响

2.3.2 离子液体对细胞代谢活性的影响

2.3.3 离子液体对细胞还原活性的影响

2.3.4 离子液体对细胞形态的影响

2.4 本章小结

第三章水/离子液体两相体系中微生物细胞催化不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯

3.1 前言

3.1.1 制备光学活性4-氯-3-羟基丁酸乙酯的意义

3.1.2 制备光学活性CHBE 的研究现状

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 水/离子液体两相相体积比对出芽短梗霉 CGMCC 1244 细胞催化不对称还原反应的影响

3.3.2 水/离子液体两相中摇床转速与温度对出芽短梗霉 CGMCC 1244 细胞催化不对称还原反应的影响

3.3.3 水/离子液体两相中 pH 对出芽短梗霉 CGMCC 1244 细胞催化不对称还原反应的影响

3.3.4 水/离子液体两相中不同底物量对出芽短梗霉 CGMCC 1244 细胞催化不对称还原反应的影响

3.3.5 水/离子液体两相体系与水相体系对出芽短梗霉 CGMCC 1244 细胞催化不对称还原反应的比较

3.3.6 离子液体的反复回收利用

3.3.7 水/离子液体两相体系中固定化细胞催化COBE 的不对称还原

3.4 本章小结

第四章水/离子液体两相体系中微生物细胞催化不对称还原TFAAE

4.1 前言

4.1.1 含氟化合物的概况

4.1.2 （R）-4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯概况

4.1.3 （R）-4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯的应用及其国内外研究进展

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 方法

4.3 结果与讨论

6]两相体系中葡萄汁酵母 Saccharoinyces uvarum SW-58 细胞不对称还原TFAAE 反应的影响'>4.3.1 相体积比对水/[bmim][PF₆]两相体系中葡萄汁酵母 Saccharoinyces uvarum SW-58 细胞不对称还原TFAAE 反应的影响

6]两相体系中葡萄汁酵母 Saccharoinyces uvarum SW-58 细胞不对称还原TFAAE 反应的影响'>4.3.2 pH 对水/[bmim][PF₆]两相体系中葡萄汁酵母 Saccharoinyces uvarum SW-58 细胞不对称还原TFAAE 反应的影响

6]两相体系中葡萄汁酵母Saccharoinyces uvarum SW-58细胞不对称还原TFAAE 反应的影响'>4.3.3 温度对水/[bmim][PF₆]两相体系中葡萄汁酵母Saccharoinyces uvarum SW-58细胞不对称还原TFAAE 反应的影响

6]两相体系中葡萄汁酵母 Saccharoinyces uvarum SW-58 细胞不对称还原TFAAE 反应的影响'>4.3.4 振摇速度对水/[bmim][PF₆]两相体系中葡萄汁酵母 Saccharoinyces uvarum SW-58 细胞不对称还原TFAAE 反应的影响

6]两相体系中葡萄汁酵母 Saccharoinyces uvarum SW-58 细胞不对称还原TFAAE 反应的影响'>4.3.5 底物浓度对水/[bmim][PF₆]两相体系中葡萄汁酵母 Saccharoinyces uvarum SW-58 细胞不对称还原TFAAE 反应的影响

6]两相体系中分批流加底物对葡萄汁酵母 Saccharoinyces uvarum SW-58 细胞不对称还原TFAAE 反应的影响'>4.3.6 水/[bmim][PF₆]两相体系中分批流加底物对葡萄汁酵母 Saccharoinyces uvarum SW-58 细胞不对称还原TFAAE 反应的影响

6]两相体系中葡萄汁酵母Saccharoinyces uvarum SW-58细胞不对称还原TFAAE 还原反应的时间曲线'>4.3.7 水/[bmim][PF₆]两相体系中葡萄汁酵母Saccharoinyces uvarum SW-58细胞不对称还原TFAAE 还原反应的时间曲线

4.3.8 重结晶法提高ee 值

4.4 本章小结

第五章离子液体/水两相中还原反应放大及产物提取研究

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 材料

5.2.2 实验方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 1L 反应体系中还原反应时间曲线

5.3.2 产物的提取与纯化

5.3.3 离子液体的回收

5.4 本章小结

结论与展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

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