论文摘要
背景与目的侵袭性真菌感染（invasive fungal infection,IFI）诊断困难、病死率高,是血液病患者尤其是异基因造血干细胞移植（allogeneic haematopoietic stem cell transplant,allo-HSCT）患者的一个重要生命威胁。随着近年来血液病诊断、治疗进展以及支持治疗改善,尤其是无关供者、HLA不合供者以及单倍体移植技术进展,越来越多的患者进行了allo-HSCT,血液病患者预后有了极大的改善、生存期明显延长,然而这也导致了IFI发生率的显著提高,IFI已成为移植患者最重要的感染性死亡原因。然而尽管免疫抑制状态相似,但并非所有患者最终发展为IFI。这引导我们关注患者自身的免疫状况及其和IFI之间的关系。目前已知不同机体对感染性疾病的易感性有很大差别,宿主遗传因素在此起了关键作用,同时宿主免疫机理决定了其对感染的反应及病理结果。多态性（polymorphism）是指在一个生物群体中,同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型（genotype）或等位基因（allele）,亦称遗传多态性（genetic polymorphism）或基因多态性。人类基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性,疾病临床表现的多样性,以及对药物治疗的反应性上都起着重要的作用。通过基因多态性的研究,可以从基因水平揭示人类不同个体间生物活性物质的功能及效应存在着差异的本质。尤其是IFI作为一种机会性感染,临床表现、病理结果多样,可以很好地阐释宿主遗传学影响。细胞因子（cytokines）在抗真菌免疫中具有重要意义,Thl细胞因子（主要有IL-12、IFN-γ、TNF-a、IL-6、IL-1）是主要的抗真菌免疫保护因素,激活中性粒细胞和肺泡巨噬细胞；而Th2细胞因子（主要有IL-4、IL-10）通过减少Thl细胞因子和疾病进展、更多的组织损伤以及恶劣的预后相关。细胞因子由活化的免疫细胞（包括淋巴细胞和非淋巴细胞）和某些基质细胞产生,是介导细胞增殖、分化,产生功能和维持生存的细胞间信号分子。细胞因子的合成、分泌和生物学效应受细胞因子基因的调控,合成量个体差异很大,有的可相差10倍以上。差别的主要原因是细胞因子基因型的变异及基因调节区或启动区的多态性。国外进行了一些关于免疫遗传变异同IFI相关性的研究,发现机体免疫的一些主要成分与IFI易感性存在很大关联,如TLR4 Asp299Gly、Thr399Ile, TLR1 Arg80Thr, TLR6 Asn248Ser、Ser249Pro; MBL低产型（如MBL54G/A、HYPD单倍型等）,MASP2 Asq472Asn; IL-15+13689A/T, TNF-a-308G/A, IFN-γ+874T/A, CXCL1011101C/T、1642C/G、-1101A/G等。但查阅现有文献中国人群没有发现TLR4 Asp299Gly、Thr399Ile多态性；且亚洲人群MBL2基因第一外显子以第54位密码点突变为主,有文献报道广东地区汉族人群MBL54G/A突变频率为0.05。某些细胞因子突变频率则很高,如有文献报道广东汉族人群TNF-a-308 G/A突变频率为0.354,IFN-γ+874T/A突变频率为0.293,故我们仅选择这些在中国人群中高突变基因行多态性的研究,探讨其对IFI易感性的影响。国内目前尚无关于IFI最高危人群—血液肿瘤患者IFI易感遗传因素的报道,因基因多态性存在种族及地域差别,国外有关免疫遗传变异并不一定适应我国情况,故而研究我国IFI相关的免疫基因多态性有着重大意义。根据我国人群基因多态性的特点,我们选择细胞因子基因多态性为研究靶点,以血液病患者为研究对象,探讨IFI易感的遗传因素,希望实现对免疫抑制患者,尤其是恶性血液病患者IFI发生危险性的分层预测的可能性,也为IFI诊断标准中宿主因素的分层提供依据,为探讨对恶性血液病患者施行个性化的预防、治疗策略提供依据。方法一、长短疗程伊曲康唑一级预防下allo-HSCT患者IFI发生状况的观察1.病例资料：2008年8月至2010年11月南方医科大学南方医院血液科接受allo-HSCT的血液病患者共163例,其中102例符合入组条件,随机分配分别接受长、短疗程（预防用药分别至移植后90天和移植后30天）伊曲康唑真菌一级预防。其中长疗程组48例,短疗程组54例。常规行预处理、GVHD预防、支持治疗等,随访至2010-12-31,中位随访时间298.5天。2.统计学分析：应用SPSS17.0软件对全部资料进行统计处理,定量资料用t检验,定性资料用χ2检验。二、细胞因子基因多态性对血液病患者IFI易感性的研究1.病例选择：从南方医院血液科有完整病史资料,具备长期随访条件的血液病患者中,选择接受至少大于2个疗程化疗或接受allo-HSCT且有IFI患者（确诊或临床诊断）53例,其中接受allo-HSCT患者16例；正常对照组选择籍贯匹配的健康正常人65例。2.血样采集：采集患者或健康对照者外周血样2ml,移植患者采集其供者外周血或完全植入后的受者外周血,-20度保存。3.对IFI患者和健康正常人进行细胞因子基因多态性分析：采用聚合酶链反应-限制性内切酶法（PCR-RFLP）分析TNF-a-308G/A、TGFβ1+869C/T多态性；序列特异性引物-聚合酶链反应（PCR-SSP）分析IFN-γ+874T/A多态性。4.采用描述性分析对各基因突变类型进行分析；采用Pearsonχ2检验比较基因分布频率、各基因型和等位基因在IFI患者和健康对照中有无差异,采用SPSS17.0软件进行统计分析。结果1.我院102例接受长、短疗程伊曲康唑真菌一级预防的allo-HSCT患者90天、180天、12月的OS分别为89.8%、83.2%、76.8%。真菌感染发生情况：移植后30天、90天、180天、12月时IFI发生率分别为7.84%、9.80%、10.78%和24.51%,和文献报道相符。长、短疗程两组真菌突破率分别为10.4%和7.4%,移植后30天、90天、180天、12月时IFI感染率分别为分别为8.3%和7.4%；10.4%和9.3%；10.4%和11.2%；10.4%和21.4%,差异无统计学意义（P=0.643）,两组患者生存率亦无显著性差异（P>0.05）。2.TNF-a-308G/A、TGFβ1+869C/T、IFN-γ+874T/A的基因型分布频率IFI组与健康对照组：TNF-α-308位点GG和非GG的基因型在IFI组中的分布频率分别为71.7%、28.3%,在健康对照组中分别为44.6%、45.4%。两组间GG和非GG基因型分布频率存在统计学差异（χ2= 8.726,P=0.003）。TGF-β1+869位点CC和非CC基因型在IFI组的分布频率分别为45.3%、54.7%；在健康对照组中分别为21.54%、78.46%。两组间各基因型分布频率存在统计学差异（χ2=7.539,P=0.006）。IFN-γ+874位点TT和非TT基因型在IFI组的分布频率分别为32.1%、67.9%；在健康对照组中分别为21.54%、78.46%。两组间各基因型分布频率存在统计学差异（22=5.647,P=0.017）。3.TNF-a-308G/A、TGFβ1 869C/T、IFN-γ+874T/A基因型与IFI易感性的关系3.1 TNF-a-308基因型与IFI易感性的关系①TNF-a-308基因型对IFI易感性具有统计学意义（P=0.003）。相对于GG型,非GG型（GA、AA）是IFI发生的保护性因素（OR=0.318,95%CI=0.147-0.688）。②携带A等位基因者不易发生IFI,其差异有统计学意义（χ2=9.279,P=0.002）。携带A等位基因是IFI的保护因素（OR=0.386,95% CI=0.207-0.720）。3.2 TGFβ1 869C/T基因型与IFI易感性的关系①TGF-β1基因型对IFI易感性具有统计学意义（P=0.003）,相对于CC基因型,非CC型（CT、TT）是IFI发生的保护因素（OR=0.302,95%CI=0.134-0.681）。②携带T等位基因者不易发生IFI,其差异有统计学意义（χ2=5.259,P=0.022）。携带T等位基因是IFI的保护因素（OR=0.545,95% CI=0.324-0.918）。3.3 IFN-γ+874T/A基因型与IFI易感性的关系①IFN-γ+874基因型对IFI易感性具有统计学意义（P=0.017）,相对于非TT（TA.AA）基因型,TT型是IFI发生的危险因素（OR=2.938,95%CI=1.183-7.300）。②携带T等位基因或A等位基因对IFI无影响（χ2=3.049,P=0.081）。结论1、长、短疗程伊曲康唑真菌预防疗效及移植后生存率无统计学差异。2、IFI组和健康对照组TNF-a-308、TGFβ1 869、IFN-γ+874基因型分布频率存在差异。3、TNF-a-308G/A多态性与IFI发生有关：相对于GG型,GA、AA型是IFI发生的保护因素,携带A等位基因是发生IFI的保护因素。4、TGFβ1 869C/T多态性与IFI发生有关：相对于CC型,TC、TT型是IFI发生的保护因素,携带T等位基因是发生IFI的保护因素。5、IFN-γ+874T/A多态性与IFI发生有关：相对于非TT基因型,TT型是IFI发生的危险因素,携带T等位基因或A等位基因对IFI发生无影响。