纳米雄黄制备及诱导U937肿瘤细胞凋亡机制研究

论文摘要

砷剂在治疗血液肿瘤方面已取得了令人瞩目的成绩,尤其是近年来对急性早幼粒细胞白血病（APL）的治疗已得到世界的公认,目前用于治疗APL的砷化合物主要是雄黄和As2O3。本课题组近年来开发的复方黄黛片对急性早幼粒细胞白血病的完全缓解率达98.6%。其中君药雄黄为硫化物类矿物雄黄族雄黄,主要成分为四硫化四砷,难溶于水,在胃肠道仅极少部分被吸收。随着纳米技术在中医药学中的应用,已有研究证明纳米技术可以改变雄黄的理化性质、增加其水溶性,从而达到减毒增效的用药目的。为了进一步完善纳米级雄黄的制备工艺,提高其生物利用度,本文对纳米雄黄粉体（nanoparticle realgar powders,NRP）的制备工艺、分析方法及其诱导细胞凋亡的机制进行了较为系统的研究。主要对纳米雄黄粉体的制备工艺进行了优化,建立了纳米雄黄粉体的粒度分析研究方法,并对纳米雄黄粉体在小鼠体内的药动学进行了初步研究。同时本文也深入研究了PI3-K/Akt和SIRT1/p53途径在纳米雄黄粉体诱导U937细胞凋亡过程中所发挥的作用。在对纳米级雄黄制备工艺进行优化研究的实验中,我们利用温度可控惰性气体高能球磨机来制备纳米级雄黄粉体,采用正交设计实验方法,对球料比（4:1～16:1）、球磨转速（23～38Hz）、球磨时间（4～16h）、球磨介质去离子水量（10～150mL）、球磨温度（-20～10℃）等球磨参数进行五因素四水平的正交实验设计。实验结果表明,制备纳米级雄黄的最佳工艺参数为球料比16:1、球磨转速38Hz、球磨温度-20℃、球磨时间12 h、去离子水量取50 mL。采用扫描电镜和原子力显微镜对纳米雄黄表观形貌进行直接观察测定,用激光光散射法对纳米雄黄的粒度分布范围进行分析测定。经扫描电镜、原子力显微镜和激光散射颗粒度测定仪的测量,结果表明经上述优化工艺制备的纳米雄黄制剂粒径在100 nm以下的达90%,其中较大颗粒是由粒径在5～30 nm左右的细小晶粒和其周围的非晶体聚集而成。实验结果表明,扫描电镜法、原子力显微镜法和激光光散射法快速、简便、准确,可用于纳米雄黄的粒度检测。小鼠体内药动学研究结果:纳米雄黄中砷在小鼠体内的药动学行为符合开放性血管外给药—室模型—级速率过程;纳米雄黄与传统水飞雄黄的药代动力学参数经统计学分析均有显著差异（P<0.05）;与传统水飞雄黄相比,纳米雄黄中砷达峰时间早、峰浓度高、AUC大,在体内吸收快,消除慢,药物在体内维持时间长。体外活性实验证明:纳米雄黄可明显诱导肿瘤细胞NB4、HL-60、K562及U937产生凋亡,对U937作用尤为明显,本文对PI3-K/Akt和SIRT1/p53途径在纳米雄黄粉体诱导U937细胞凋亡过程中所发挥的作用进行了深入讨论。将20,40,60,80或100μg/mL的NRP作用于淋巴瘤U937细胞12,24,36或48小时,通过MTT法检测到NRP诱导U937细胞的死亡成一定时间和浓度依赖性。荧光显微镜下细胞呈明显的凋亡形态学特征,细胞膜出泡、细胞核浓缩且有颗粒状的凋亡小体出现。采用乳酸脱氢酶活力（LDH）实验,测定凋亡和坏死细胞的比例,20～80μg/mLNRP作用U937细胞24h,凋亡的细胞显著增加,而坏死的细胞没有显著的变化且仍低于10.8%,当NRP的浓度增加至120μg/mL时,凋亡细胞比率开始明显下降,坏死细胞比率开始明显增加,结果表明NRP诱导U937细胞的死亡过程是一个介于细胞凋亡与细胞坏死之间的平衡过程。我们采用流式细胞术和Western blot方法相结合,检测了PI3-K/Akt途径对NRP诱导U937细胞凋亡的影响,实验结果表明PI3-K/Akt途径对细胞凋亡具有保护作用,而NRP通过抑制PI3-K/Akt途径的活化从而促进了U937细胞的凋亡。我们采用MTT法和Western blot方法进一步考察了SIRT1和p53在NRP诱导U937细胞凋亡过程中所发挥的作用,结果表明NRP活化了p53,而SIRT1的抑制剂sirtinol进一步增强了p53的活化。且Western blot结果显示,PI3-K的抑制剂wortmannin对SIRT1的表达有明显的抑制作用,从而增强了p53的活化作用。以上结果说明,在NRP诱导U937细胞死亡过程中,PI3-K/Akt信号通路与SIRT1/p53信号通路密切相关。NRP抑制了PI3-K/Akt途径的激活,从而抑制了SIRT1蛋白表达,使p53进一步激活,并引发了U937细胞通过caspase途径进行的凋亡。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• Abbreviation
• 第一章 前言
• 第一节 纳米技术在中药制剂中的应用
• 1.1 纳米技术简介
• 1.2 纳米中药简介
• 1.3 纳米粒度分析方法简介
• 1.4 问题与展望
• 参考文献
• 第二节 细胞凋亡机制研究进展
• 2.1 细胞凋亡
• 2.2 细胞凋亡与肿瘤
• 2.3 细胞凋亡的调控信号及信号转导途径
• 参考文献
• 第二章 纳米级雄黄的制备与小鼠体内药动学研究
• 第一节 纳米级雄黄的制备工艺优化
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 实验结果
• 1.4 小结与讨论
• 第二节 纳米雄黄粒度的分析方法研究
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 小结与讨论
• 第三节 纳米雄黄在小鼠体内药动学研究
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 小结与讨论
• 参考文献
• 第三章 PI3-K/Akt途径在纳米雄黄粉体诱导U937细胞凋亡中的作用机制的研究
• 第一节 实验部分
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 第二节 实验结果
• 2.1 NRP的制备
• 2.2 NRP对U937细胞生长的作用
• 2.3 NRP诱导的U937细胞凋亡与死亡
• 2.4 PI3-K的失活对NRP诱导的U937细胞死亡的作用
• 2.5 Akt对NRP诱导的U937细胞凋亡的影响
• 2.6 在NRP诱导的U937细胞凋亡过程中SIRT1的失活促进了p53的活化
• 2.7 PI3-K/Akt途径的失活促进了SIRT1表达的下降和p53的活化
• 第三节 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢
• 附录