山羊黄体细胞的分离培养和鉴定方法的研究

论文摘要

为了建立了山羊黄体细胞的培养模型,寻找黄体细胞的鉴定方法,通过RT-PCR检测黄体细胞、卵巢颗粒细胞和卵巢间质细胞孕酮合成酶3β-HSD和17β雌二醇合成酶17β-HSD7的mRNA表达,并结合细胞免疫组化对比检测黄体细胞、卵巢颗粒细胞和卵巢间质细胞中的DNES标志物SYP、S100、5-HT和NSE以及关键酶3β-HSD、17β-HSD7和P450scc和催产素OT,从而得到以下结果:1.成功建立山羊黄体细胞培养模型。山羊黄体细胞胶原酶Ⅳ消化法培养效果较好,贴壁细胞数较多。为了研究黄体细胞鉴定方法,同时培养了卵巢颗粒细胞和卵巢间质细胞。通过生长曲线对比可见,卵巢颗粒细胞和卵巢间质细胞生长速度明显高于黄体细胞,同时妊娠期黄体细胞的生长速度也高于发情期黄体细胞。2.RT-PCR的检测结果显示,3β-HSD在卵巢三种细胞中都有表达,而17β-HSD7在黄体中有大量表达,而颗粒细胞中有少量表达,间质细胞中没有表达。因此17β-HSD7作为黄体细胞鉴定更具准确性。3.通过对三种卵巢细胞中进行细胞免疫组化,对比3β-HSD、17β-HSD7、P450scc、OT、SYP、S100、5-HT和NSE在三种卵巢细胞的染色结果,可知3β-HSD、P450scc、5-HT和NSE在三种卵巢细胞中的结果为阳性,而17β-HSD7和S100在黄体细胞和卵巢颗粒细胞的染色结果阳性,可以用以区分卵巢间质细胞。OT和SYP只在黄体细胞的表达为阳性。4.通过检测不同卵泡大小的颗粒细胞的端粒酶活性和不同六个时期的黄体细胞的端粒酶活性,发现不同时期的黄体细胞端粒酶活性为阴性而颗粒细胞的端粒酶活性随卵泡的生长而减小。同时免疫组化切片检测发现端粒酶蛋白组分TERT存在于黄体细胞和颗粒细胞。据此可得出结论:在mRNA水平上17β-HSD7可作为鉴定黄体细胞的分子生物学方法。在蛋白水平上,SYP结合OT的表达可以作为黄体细胞的鉴定方法。此外,通过端粒酶活性检测得知,黄体细胞中没有端粒酶活性,而颗粒细胞的端粒酶活性随卵泡的成熟增大而降低。同时TERT存在于黄体细胞和颗粒细胞。因此,结合端粒酶活性存在与否可以作为黄体细胞鉴定的辅助条件,而且黄体细胞的凋亡可能与端粒酶活性丧失有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 卵巢中的黄体
• 1.1 黄体的形成
• 1.2 黄体细胞的种类
• 1.3 黄体的功能
• 1.3.1 黄体的类固醇生成
• 1.3.2 激素调节
• 1.4 黄体中的弥散性神经内分泌细胞及其标志物
• 1.4.1 神经元特异性烯醇化酶（NSE）
• 1.4.2 S100 蛋白
• 1.4.3 突触素（synaptophysin，SYP）
• 1.4.4 5-HT
• 1.5 展望
• 第二章 卵巢中的端粒酶
• 2.1 卵巢中的端粒酶
• 2.2 端粒和端粒酶：细胞的再生机制
• 2.3 卵泡发育过程中颗粒细胞的端粒酶作用
• 2.4 展望
• 试验部分
• 第三章 山羊黄体细胞的分离培养和鉴定方法的研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 主要试剂及配制
• 3.1.3 主要仪器和设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 山羊卵巢黄体细胞的分离与培养
• 3.2.2 山羊卵巢颗粒细胞的分离与培养
• 3.2.3 山羊卵巢间质细胞的分离与培养
• 3.2.4 细胞纯化
• 3.2.5 细胞传代
• 3.2.6 细胞生长曲线的测定
• 3.2.7 山羊黄体细胞的鉴定方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 山羊黄体细胞体外培养的形态和特征
• 3.3.2 山羊间质细胞体外培养的形态和特征
• 3.3.3 山羊颗粒细胞体外培养的形态和特征
• 3.3.4 山羊黄体细胞、颗粒细胞和卵巢间质细胞的生长曲线
• 3.3.5 RT-PCR 检测3β-HSD 和17β-HSD7 的mRNA 表达
• 3.3.6 细胞免疫组化检测不同物质的表达
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 黄体细胞的端粒酶活性检测
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 主要试剂及配制
• 4.1.3 主要仪器和设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 山羊卵巢黄体细胞的分离与培养
• 4.2.2 山羊卵巢颗粒细胞的分离与培养
• 4.2.3 端粒酶活性的检测
• 4.2.4 免疫组化法检测端粒酶的表达
• 4.3 结果
• 4.3.1 TRAP-ELISA 端粒酶活性检测结果
• 4.3.2 免疫组化法检测TERT 的表达
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介