芪合酶基因的克隆及其对甜瓜的遗传转化

论文摘要

白黎芦醇在结构分类上属于芪类，是芪类最重要的活性成分之一。人们很早就发现含有芪类的树木不易腐烂，所以芪类有“植物杀菌素”之称。现代药理实验表明，白黎芦醇具有广泛的生理活性和多种保健功能，对芪类成分的研究是当今人们在植物抗病性和植物保健品开发中十分关注的课题。白藜芦醇和其它芪类化合物的生物合成属于次生代谢，是通过苯丙氨酸代谢途径合成的。其中最关键的调节酶是芪合酶。 白藜芦醇仅存在于葡萄、花生等少数植物体内。一般植物体内虽然含有芪合酶的底物，但没有芪合酶基因而不能合成白藜芦醇。应用芪合酶基因转化植物从而提高植物抗病性和品质越来越受到重视。 虎杖为蓼科多年生草本植物，是到目前为止人们发现的自然界中含白藜芦醇最高的植物；羊蹄甲是豆科绿化树种，果荚中亦含有白藜芦醇。 甜瓜为葫芦科一年生蔓性草本植物，其果实营养丰富、风味独特、香甜可口，深受人们喜爱，被列入世界十大水果之一。我国是甜瓜第一生产大国，约占世界总面积和总产量的一半。目前我国甜瓜主要分为薄皮甜瓜和厚皮甜瓜两大系列。 从1983年世界上第一例转基因植物问世以来，转基因技术迅速发展，为培育出高产、优质、抗病虫、抗逆境的优良品种开辟了新途径，并已取得重大突破，产生了巨大的社会和经济效益。但该技术在瓜类作物中的应用研究起步较晚，加之甜瓜存在组培再生成苗率低和遗传转化体系的建立较难等问题，因而转基因研究较为落后。 本论文主要试验结果和结论如下： 1．测定了若干果树的果实及药用植物中白藜芦醇的含量 本研究对十几种果树的果实进行检测，结果发现在桑椹、菠萝、蒲桃、葡萄、假槟榔等的果实中含有白黎芦醇。其含量的高低趋势是：桑椹＞菠萝＞蒲桃＞葡萄＞假槟榔。因此，从食用果实角度利用白黎芦醇的保健作用来看，桑椹、菠萝和蒲桃比葡萄价值更高，将有较好的开发应用前景。 虎杖作为一种中药材，其药用部分为多年生根，因此对虎杖药用成分及价值的研究几乎都集中在根上，本试验测得虎杖叶片中的白藜芦醇含量甚高，为764.74μg/g，叶片产量大，又可重复采收，从环境资源的保护和可持续利用方面看，开发利用虎杖叶片中的白黎芦醇具有很好的前景。 2．采用染色体步移等技术克隆了虎杖芪合酶基因 本试验得到1567bp长的芪合酶基因片段，利用DNAMAN分析软件，将

论文目录

• 独创性声明
• 论文使用授权的说明
• 缩写词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 一 文献综述
• 1 白藜芦醇概述
• 1.1 白藜芦醇的发现、性质和结构
• 1.2 白藜芦醇的药理作用
• 1.3 植物中的白藜芦醇及其生物合成
• 2 芪合酶基因研究进展
• 2.1 芪合酶基因的结构和功能
• 2.2 芪合酶基因工程研究进展
• 3 甜瓜基因工程研究进展
• 3.1 甜瓜组织培养研究进展
• 3.2 甜瓜转基因进展
• 二 研究工作的意义
• 三 研究内容
• 四 技术路线
• 第一章 植物中白藜芦醇含量的测定
• 1 试验仪器、试剂和材料
• 1.1 供试植物材料
• 1.2 主要仪器与试剂
• 2 测定方法
• 2.1 供试样品的制备
• 2.2 色普分离条件
• 2.3 标准曲线和最小检测限
• 2.4 样品中白藜芦醇的测定
• 3 测定结果与分析
• 3.1 高效液相色谱图谱分析
• 3.2 虎杖及部分果实中白藜芦醇的含量
• 第二章 虎杖芪合酶基因的克隆
• 1 试验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂盒、酶和Marker
• 1.4 菌株和克隆载体
• 2 试验方法
• 2.1 虎杖基因组嫩茎DNA的提取、电泳和紫外分析测定
• 2.1.1 虎杖嫩茎基因组DNA的提取步骤
• 2.1.2 电泳分析和紫外分光光度测定
• 2.2 引物设计与合成
• 2.3 虎杖芪合酶基因保守区的克隆
• 2.3.1 虎杖芪合酶基因保守区的PCR扩增
• 2.3.2 目的片段的回收
• 2.3.3 目的片段与载体的连接
• 2.3.4 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
• 2.3.5 连接产物的转化、筛选、重组质粒的PCR检测与测序
• 2.4 虎杖芪合酶基因3′端和5′端序列的克隆
• 2.4.1 虎杖芪合酶基因组DNA的酶切
• 2.4.2 酶切片段与接头的连接反应
• 2.4.3 虎杖芪合酶基因3′端和5′端序列的PCR扩增
• 2.4.4 PCR产物的回收、连接、转化、重组质粒的PCR检测与测序
• 3 结果与分析
• 3.1 虎杖嫩茎基因组DNA的不同提取方法的比较
• 3.2 虎杖芪合酶基因的克隆与序列分析
• 3.3 讨论
• 第三章 羊蹄甲果荚芪合酶cDNA全长的克隆
• 1 试验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂盒、酶和Marker
• 1.4 菌株和克隆载体
• 1.5 试验用具与耗材
• 2 试验方法
• 2.1 羊蹄甲果英总RNA的提取与检测
• 2.1.1 羊蹄甲果荚总RNA的提取步骤
• 2.1.2 电泳分析和紫外分光光度测定
• 2.2 羊蹄甲果英芪合酶保守区cDNA的克隆
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 羊蹄甲果荚芪合酶保守区cDNA的RT-PCR扩增
• 2.2.3 目的片段的回收、连接、转化和蓝白斑筛选
• 2.2.4 重组质粒的PCR检测
• 2.3 羊蹄甲芪合酶eDNA全长的克隆
• 2.3.1 引物设计及合成
• 2.3.2 第一链cDNA的合成
• 2.3.3 cDNA末端的快速扩增
• 2.3.4 目的片段的回收、连接、转化和蓝白斑筛选
• 2.3.5 重组质粒的PCR检测
• 3 结果与分析
• 3.1 羊蹄甲果英总RNA的提取结果
• 3.2 羊蹄甲果荚芪合酶保守区cDNA的PCR扩增与序列分析
• 3.3 羊蹄甲果荚芪合酶cDNA的RACE与序列分析
• 3.4 羊蹄甲果荚芪合酶cDNA全长的获得与序列分析
• 3.5 讨论
• 第四章 芪合酶基因对甜瓜的遗传转化
• 1 试验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂
• 1.2.1 工具酶、生化试剂和试剂盒
• 1.2.2 培养基、抗生素及生长调节剂
• 1.2.3 载体及菌株
• 2 试验方法
• 2.1 甜瓜遗传转化体系的建立
• 2.1.1 无菌苗的获得
• 2.1.2 不定芽的诱导
• 2.1.3 不定芽的伸长与生根培养
• 2.1.4 抗生素敏感性试验
• 2.2 芪合酶基因植物表达载体的构建
• 2.2.1 羊蹄甲芪合酶基因全长的获得
• 2.2.2 质粒的提取
• 2.2.3 质粒的酶切
• 2.2.4 连接
• 2.2.5 连接产物的转化、筛选及重组质粒鉴定
• 2.3 芪合酶基因对甜瓜的遗传转化
• 2.3.1 农杆菌感受态细胞的制备及重组质粒对农杆菌的转化
• 2.3.2 转化用外植体的准备
• 2.3.3 侵染用工程菌液的准备
• 2.3.4 农杆菌的侵染
• 2.3.5 转基因植株的获得
• 2.4 转基因植株的检测
• 2.4.1 转基因植株的PCR检测
• 2.4.2 转基因植株中自藜芦醇含量的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 遗传转化体系的优化
• 3.1.1 生长调节剂对不定芽分化的影响
• 3.1.2 子叶生长天数对不定芽诱导的影响
• 3.1.3 培养基成分对苗生长的影响
• 3.1.4 生长调节剂对试管苗生根的影响
• 3.1.5 抗生素对植株再生的影响
• 3.2 芪合酶基因植物表达载体的构建
• 3.3 转基因植株的检测
• 3.3.1 转基因植株的PCR检测结果
• 3.3.2 转基因植株中白藜芦醇含量的测定结果
• 3.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 附录4
• 附录5
• 附录6
• 附录7
• 附录8
• 附录9
• 附录10
• 附录11
• 附录12
• 博士在读期间发表的学术论文
• 致谢