VTC1与CSN5B的互作影响拟南芥VC含量及氧化胁迫反应

论文摘要

维生素C（VC）是普遍存在于植物和真核藻类体内的高丰度水溶性小分子抗氧化物质,在植物的生长发育、非生物胁迫和生物胁迫应答中具有重要的生物学功能。已有证据表明植物体内存在多条VC合成途径,包括L-半乳糖途径、古洛糖途径、糖醛酸途径和肌醇途径。其中L-半乳糖途径把VC的生物合成融入碳水化合物的主要代谢过程并与多糖合成及蛋白质糖基化联系起来,已被公认为植物中VC合成的最主要途径。研究表明,拟南芥GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GMPase）是此途径中的一个关键酶,编码该酶的基因命名为VTC1。VTC1点突变体vtc1-1并没有改变VTC1的转录表达,只是降低了35%酶活以及70%VC含量（仅为野生型VC含量的25-30%）,导致对臭氧、UV-B、SO2、高光强、盐、H2O2的敏感性。光是影响植物体内VC含量的一个重要环境因子,且VC在光保护中起重要作用。光合作用、光呼吸和其它氧化胁迫产生的活性氧（ROS）都可以通过VC清除。拟南芥L-半乳糖途径的几个重要酶均在转录水平上受到光调控,VTC1、GPP、GalLDH、VTC2在持续光照下基因表达升高,持续暗处理下基因表达降低。但是目前光调控VC合成的机制尤其是在蛋白水平上还不是很清楚。以AtVTC1为诱饵通过酵母双杂技术筛选拟南芥三天黄化苗的cDNA文库,得到三个与其互作的蛋白质因子。其中一个即为CSN5B,CSN5B是与“组成型光形态建成”密切相关的COP9信号复合体（COP9 signalosome,CSN）的一个亚基,CSN由8个亚基组成,依次为CSN1—8,此复合物可以通过泛素降解途径调节植物对光信号的应答,从而使植物体完成从光形态建成到暗生长的转换。CSN是通过对SCF型E3-泛素连接酶的去NEDD化来调控泛素降解系统的,CSN5对于整个复合体而言具有相对独立性,CSN5的单个亚基突变就能引起CSN突变体所有表型的出现,CSN5对植物的生长发育具有重要的调控作用。通过酵母双杂交、BiFC、pull-down和CoIP等实验验证了AtVTC1与AtCSN5B确实存在相互作用。为了进一步探讨CSN5B对VTC1的调控作用,我们从植物体VC含量和对氧化胁迫耐受性方面考察了它们之间的相互作用。CSN5B缺失突变体csn5b的生长发育与野生型并无明显差异,但检测到其VC含量比野生型要高20%左右,而过表达CSN5B后VC含量比野生型低;同时过表达CSN5B后其活性氧含量比野生型有所增加。从蛋白水平上看,拟南芥VTC1过表达植株与CSN5B过表达植株杂交后VTC1的蛋白含量比杂交前明显降低。以上结果表明,拟南芥中CSN5B通过调控VTC1的降解而影响植物体内的VC含量,并进而引起植物对氧化胁迫耐受性的变化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 维生素 C
• 1.1.1 维生素 C 的合成
• 1.1.2 维生素 C 在植物体内的代谢
• 1.2 植物维生素 C 合成的调控
• 1.2.1 植物维生素 C 合成的影响因素
• 1.2.2 光对植物维生素 C 含量的影响
• 1.3 CSN5B
• 1.3.1 COP9 信号复合体的结构与功能
• 1.3.2 CSN5 的功能
• 1.4 研究目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 菌株及质粒
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 cDNA 文库
• 2.2 方法
• 第三章 结果与分析
• 3.1 VTC1 基因的克隆
• 3.1.1 拟南芥 RNA 的提取及检测
• 3.1.2 VTC1 基因全长的扩增及植物表达载体的构建
• 3.1.3 拟南芥农杆菌转化及转基因植株的筛选
• 3.1.4 VTC1 过表达转基因植株的鉴定
• 3.1.5 小结
• 3.2 VTC1 互作蛋白的筛选
• 3.2.1 噬菌体文库扩繁后滴度的测定
• 3.2.2 文库质粒提取后电泳检测及浓度测定
• 3.2.3 自激活检测及 3-AT 浓度的确定
• 3.2.4 酵母双杂交筛选
• 3.2.5 小结
• 3.3 VTC1 与 CSN5B 的相互作用
• 3.4 CSN5B 对拟南芥 VC 含量及氧化胁迫耐受性的影响
• 第四章 讨论
• 第五章 全文结论
• 5.1 结论
• 5.2 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历