琼胶酶高产菌株的筛选、酶的分离纯化及红藻原生质体的酶法制备

论文摘要

海藻的原生质体制备被广泛应用于生理学、生物化学、遗传学研究,也是海产品养殖、育种中的重要技术。而且,从原生质体出发,可以制备多种对于科研和生产非常有价值的复合物。目前,海藻原生质体的生产主要是使用海洋细菌所产解壁酶进行酶法制备,这些酶包括纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶和琼胶酶等。红藻门包括多种形态、性质各异的海藻,其细胞壁成分随着生长时期、生理状态、培养条件的不同而处于动态变化中。因此找到一种能有效降解红藻细胞壁的酶以大量制备原生质体,就成为开展红藻相关研究的关键。红藻细胞壁共有的主要成分是琼胶——包括琼脂糖和琼脂胶,而琼胶酶就是专一降解这种多糖的水解酶。本文从在烟台沿海采集的多种红藻表面分离到一株高产琼胶酶的革兰氏阴性菌。该菌株不能降解纤维素和淀粉,也不能液化明胶。16SRNA分析表明其与Agarivorans sp.的同源性在99%以上,故命名为Agarivorans sp.SM0527。同时,本文对SM0527发酵产琼胶酶的条件进行了优化:人工海水配制,含琼脂0.5%,酵母粉0.5%,发酵起始pH 7.0,500 ml三角瓶中装培养基100ml,接种量为5%,培养时间为60小时。在上述条件下,发酵液中琼胶酶的酶活可达到3300 IU/ml。发酵的粗酶液通过离心、硫酸铵沉淀和阴离子交换层析,得到一个分子量大约90 kD的琼胶酶。该酶最适反应pH值为8.5,最适反应温度为45℃,最适反应时间为10 min。本文使用SM0527所产的琼胶酶及本试验室保存的拟康氏木霉Trichodermapseudokoningii K9301所产的纤维素酶试验了多种红藻原生质体的制备。结果表明含琼胶酶10%-15%,纤维素酶1%-2%的混合酶对于条斑紫菜、江蓠、三叉仙菜、海头红细胞壁都有良好的酶解效果。在使用葡萄糖作为渗透稳定剂的条件下,条斑紫菜、江蓠、海头红原生质体产量分别达到了9.4×105、1.6×106、2.3×106个原生质体/克鲜藻。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 研究背景
• 1.1 琼胶酶的研究进展
• 1.1.1 琼胶酶的来源
• 1.1.2 琼胶酶的分类
• 1.1.3 琼胶酶的酶学性质研究
• 1.1.4 琼胶酶的结构研究
• 1.1.5 琼胶酶的分子生物学研究
• 1.1.6 琼胶酶的应用
• 1.2 酶法制备海藻原生质体的研究进展
• 1.2.1 海藻原生质体的用途
• 1.2.2 海藻原生质体的制备方法
• 1.2.3 酶法制备原生质体所用的酶及具体过程
• 1.3 立体依据和研究意义
• 第二章 高产琼胶酶菌株的筛选与鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.1.4 方法
• 2.1.4.1 菌株的筛选方法
• 2.1.4.2 生理生化特征检测方法
• 2.1.4.3 粗酶液制备
• 2.1.4.4 半乳糖标准曲线的测定
• 2.1.4.5 酶活力的测定
• 2.1.4.6 16SRNA的提取与测序
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 产琼胶酶菌株的筛选
• 2.2.2 革兰氏染色、菌体形态、菌落形态观察
• 2.2.3 生理生化特征
• 2.2.4 16SDNA鉴定
• 2.3 小结
• 第三章 产琼胶酶的液体发酵培养基的优化及琼胶酶的分离纯化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.3 仪器
• 3.1.4 方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 氮源对产酶的影响
• 3.2.2 琼脂浓度对产酶的影响
• 3.2.3 培养时间对产酶的影响
• 3.2.4 接种量对产酶的影响
• 3.2.5 硫酸铵沉淀
• 3.2.6 阴离子交换层析
• 3.2.7 凝胶电泳
• 3.2.8 各步骤的纯化得率分析
• 3.2.9 琼胶酶反应的最适pH值
• 3.2.10 琼胶酶的最适反应温度
• 3.2.11 琼胶酶的最适反应时间
• 3.3 小结
• 第四章 红藻原生质体的制备
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株与工具酶
• 4.1.2 材料
• 4.1.3 试剂
• 4.1.4 仪器
• 4.1.5 方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 渗透稳定剂的选择
• 4.2.2 红藻原生质体制备的条件优化
• 4.3 小结
• 第五章 工作总结和展望
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表