Cullin-5蛋白单克隆抗体的制备

论文摘要

Cul5蛋白作为E3复合物的一个支架蛋白,全长为784个氨基酸。在体外表达Cul5全长蛋白比较困难,我们通过PCR的方法获得Cul5蛋白N末端138个氨基酸的表达基因,克隆至pRSETB表达载体中,进行融合表达,获得His-融合的Cul5蛋白,经Ni-NTA亲和纯化树脂纯化获得高纯度的Cul5可溶性蛋白,SDS-PAGE鉴定蛋白的分子量为18KD左右。以纯化的Cul5蛋白作为抗原免疫雌性Balb/c小鼠,小鼠经鉴定产生抗体后,取脾细胞与处在对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞在浓度为50%的聚乙烯二醇（PEG）的作用下融合,经HAT培养基选择性培养,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤,获得了4株特异性分泌抗Cul5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过初步纯化杂交瘤细胞上清,得到高效价的抗Cul5蛋白单克隆抗体。

论文目录

• 提要
• 第一章 前言
• 1.1 HIV-1 VIF研究的背景介绍
• 1.1.1 HIV-1 Vif 蛋白介绍
• 1.1.2 APOBEC3G 蛋白介绍
• 1.2 单克隆抗体研究介绍
• 1.2.1 单克隆抗体技术概述
• 1.2.2 单克隆杭体技术的基本原理
• 1.2.3 单克隆抗体技术杂交瘤的筛选机理
• 1.2.4 单克隆抗体的优点
• 1.2.5 单克隆抗体的应用前景
• 1.2.6 单克隆抗体技术操作中存在的疑难问题
• 1.3 本论文的立题依据
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料和试剂
• 2.2 仪器与设备
• 2.3 所用主要试剂配方
• 2.4 实验方法
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 抗原的制备
• 3.1.1 Cul5 蛋白表达
• 3.1.2 纯化
• 3.2 小鼠免疫
• 3.2.1 免疫动物的选择
• 3.2.2 免疫程序的确定
• 3.2.3 小鼠血清特异性检测
• 3.3 细胞融合前的准备
• 3.3.1 骨髓瘤细胞的准备
• 3.4 细胞融合条件的优化
• 3.4.1 饲养细胞
• 3.4.2 PEG作用时间
• 3.4.3 细胞密度
• 3.5 单抗杂交瘤细胞株的建立
• 3.5.1 杂交瘤细胞筛选
• 3.5.2 抗体的检测
• 3.5.3 杂交瘤的克隆化
• 3.6 杂交瘤细胞培养上清效价的测定
• 3.7 抗体的类和亚类鉴定
• 3.8 抗体纯化
• 3.8.1 亲和层析纯化法
• 3.8.2 抗体浓度测定
• 3.8.3 抗体纯化
• 3.8.4 抗体的Western 检测
• 3.9 小结
• 参考文献
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 致谢
• 作者简历