人血清免疫球蛋白类定时散射比浊检测系统的研制

论文摘要

人体内存在着10万种以上的蛋白质,在机体中承担着不同的任务,来源于组织细胞,对维持人体机能变化起着重要的作用,当疾病状态时又起着重要病理意义的那些特殊蛋白,统称为特定蛋白。为了揭示生命活动的规律,识别和检测这些蛋白质以及生理功能是必然的发展方向。人体免疫系统中也存在着这样一类与免疫系统疾病发生、发展、转归及预后紧密关联的特定蛋白,包括免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、以及补体C3、C4。人体免疫系统是人类保持健康、避免发生各种疾病的自卫防御系统,它是人类在进化过程里,与自然环境作斗争中逐渐建立和完善的,是一个组织严密、分工精细,成员众起各种疾病时,具有抵抗力,确保人体内环境的统一、稳定和平衡。人体内免疫功能失调会引起恶性肿瘤、慢性肾病、慢性肝炎、慢性胃病、糖尿病、红斑狼疮、风湿性心脏病、硬化症、重症肌无力、类风湿、中老年性疾病等各种免疫系统疾病,严重威胁着人类的健康,随着社会的发展和医学科技的不断进步,越来越多的免疫系统疾病被人们所重视,与其密切相关的特定蛋白的检测也日益受到广大医学和科研工作者的青睐及关注。目前国内外常用的特定蛋白的检测方法包括单向免疫扩散法、免疫电泳法、酶联免疫测定（ELISA）、化学发光免疫测定（CLIA）、时间分辨免疫测定（TRFIA）、透射比浊法等,但是这些方法都存在一定的弊端,操作繁琐,费时,不易自动化,因此检测时不仅将增加被检测者的经济负担,也使检测者耗费更多时间、精力和试剂。随着实验技术的发展,特种蛋白分析技术由最初的试管沉淀反应、琼脂凝胶的扩散试验,发展到现代免疫分析技术,特种蛋白免疫分析技术方法逐步完善,其灵敏度逐步提高,检测水平由微克（μg）发展到纳克（ng）,甚至皮克（pg）水平。特种蛋白分析仪是近年来国内常购的用于检测特种蛋白的临床检验设备。特定蛋白分析仪是利用抗原-抗体在一定条件下反应形成免疫复合物的原理,用免疫浊度法检测悬浮于缓冲液中的抗原-抗体免疫复合物颗粒的定量测定方法。特种蛋白分析仪从结构上主要分为透射比浊和散射比浊。免疫比浊测定法（Immunoturbidimetry）具备生化检测的快速性和免疫分析的特异性,是将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应的方法,可对各种液体介质中的微量抗原、抗体和药物以及小分子半抗原物质进行定量测定。与其它免疫分析方法相比,免疫比浊技术除了具有操作简单、灵活、检测范围广,易于自动化等显著特点,其最突出优势还在于克服了抗原过量引起的高剂量HOOK效应。最早可追溯到1967年,Ritchie等报道了散射比浊法（Nephelometry）,其原理是光线通过检测溶液时,被其中所含的抗原抗体复合物折射而部分发生偏转,产生散射光。根据雷利散射公式,在一定条件下,透射光与微粒浓度成反比,散射光与微粒浓度成正比。散射比浊法可分为终点和速率散射比浊法及动态定时散射比浊法。而散射免疫比浊测定法,具有线性范围宽广,测定速度快,精密度高,特异性强、重复性好,结果稳定可靠,并可批量测定等优点,是一种微量、快速、自动化检测体液中特定蛋白质成分的免疫化学分析技术。近年来,国内随着临床检测需求的增加,免疫比浊测定方法的应用也越来越普遍,因此对相应试剂及缓冲液的的使用也呈广泛趋势,但是由于国内临床使用的仪器基本依赖于进口,这就引发了一个严重的问题,这些仪器大多都只能使用它们自己的原装试剂和缓冲液,而且大都价格昂贵,不适宜大批量长期使用,使其在临床使用局限化。如果能研制出与仪器配套的试剂及缓冲液,将为临床检验解决一个重大难题。目前国内也有公司进行这方面的研究,但是都不尽人意,只是停留在起步阶段。这就决定了开发配套国产试剂及其相关缓冲液具有巨大的市场前景,填补了国产试剂的空缺,可以推动国内临床检验技术的发展进步。鉴于临床上对特定蛋白检测的必要性以及目前检测手段的局限性,我们的研究目的是研制出能应用于散射免疫比浊技术的国产相关检测试剂和缓冲液,满足国内市场的需求,并为广大临床患者带去福音。本实验室采用的是动态定时散射比浊法（Fixed-Time Nephelometric AssayFTNA）,该方法的原理:由于免疫沉淀反应是在抗原抗体相遇后立即开始,在极短时间内反应介质中散射信号变动很大,此时计算峰值信号会产生一定误差。故在抗原抗体反应时留出预反应时间,即散射光信号第一次读数在开始反应7.5s～2min内,大多数情况下2min以后测第二次读数,并从第二次读数中扣除第一次读数,最后转换为待测抗原浓度。抗原、抗体剂量-反应曲线是由Heidelberger首次发现,在抗体过量阶段,沉淀物的量随着抗原浓度成比例增加,当抗原浓度的增加不再增强信号时,就达到了平衡点。进一步增加抗原的量会导致沉淀物总量减少。当抗原浓度远远超过所有抗体结合容量时,就会产生可溶性物质,接着互相交联形成的沉淀物无法检测。在抗原过量区域,所有具有较大病理学浓度范围的人体蛋白,都受到这种现象的影响。Green等根据反应曲线的形状提出了“钩状效应（Hook Effect）”的名称。目前钩状效应主要针对抗原过剩而言,我们运用的BN Prospec特种蛋白仪方法学上较其他仪器具有明显的优势:动态定时散射比浊、前向全散射的光收集和乳胶增强试剂使灵敏度提高十倍。此外,仪器还具有抗原过剩的自动稀释检测功能,间接抗原过量检测,避免了高剂量Hook效应造成的假阴性结果,检测的范围也更宽广。本研究应用抗原抗体反应原理利用动态定时散射比浊分析技术监测人血清中的免疫球蛋白系统类相关蛋白的含量,以此来评价临床疾病的发生、发展、转归以及预后。评价该方法的精密度、灵敏度、稳定性、正常参考值范围等指标,并与与Dadebehring公司的同类试剂进行了临床血清标本检测结果的相关性比较。结果显示:（1）进口原装反应液和稀释缓冲液与本实验室研制反应液和稀释液同样条件下对30份正常人标本进行对比测定结果相关性好,r=0.991,P＜0.01,线性方程为Y（自制试剂）=—0.1 1+1.012X（德灵试剂）,结果有显著统计学意义,重复性高,稳定性好,37℃条件下一年内保存均稳定有效。（2）IgA、IgG、IgM研制试剂:最低检测限分别为0.028g·L-1、0.72g·L-1、0.022 g·L-1;批内精密度2.1%～4.9%、1.6%～3.5%、3.5%～5.0%,批间精密度2.0%～3.1%、3.0%～4.5%、2.6%～4.1%:IgA样本中的游离血红蛋白、胆红素、甘油三酯等干扰物浓度分别达到10 g·L-1、600mg·L-1、9.9 g·L-1时对检测结果无显著性影响,IgG样本中的游离血红蛋白、胆红素、甘油三酯等干扰物浓度分别达到10 g·L-1、600mg·L-1、19 g·L-1时对检测结果无显著性影响,IgM样本中的游离血红蛋白、胆红素、甘油三酯等干扰物浓度分别达到10 g·L-1、600mg·L-1、4.6g·L-1时对检测结果无显著性影响:测定54份临床血清标本计算与进口同类试剂测得结果显示两种试剂相关性好,结果有显著统计学意义:IgA线性方程为Y（自制试剂）=1.101+0.881X（德灵试剂）,相关系数为0.980;IgG线性方程为Y（自制试剂）=0.148+0.901X（德灵试剂）,相关系数为0.979;IgM线性方程为Y（自制试剂）=1.045-0.075X（德灵试剂）,相关系数为0.967。正常参考值范围IgA、IgG、IgM分别为0.59～4.31g·L-1、6.9～17.92g·L-1、0.35～2.23 g·L-1。（3）补体C3、C4研制试剂:最低检测限分别为0.022 g·L-1、0.0014 g·L-1;批内精密度2.0%～4.9%、4.5%～5.0%,批间精密度5.4%～6.8%、3.8%～5.1%;C3样本中的游离血红蛋白、胆红素、甘油三酯等干扰物浓度分别达到10 g·L-1、600mg·L-1、5.7 g·L-1时对检测结果无显著性影响,C4样本中的游离血红蛋白、胆红素、甘油三酯等干扰物浓度分别达到10 g·L-1、600mg·L-1、2.4g·L-1时对检测结果无显著性影响;测定54份临床血清标本计算与进口同类试剂侧得结果显示两种试剂相关性好,结果有显著统计学意义:C3线性方程为Y（自制试剂）=-0.245+1.006X（德灵试剂）,相关系数为0.974;C4线性方程为Y（自制试剂）=1.101+0.993X（德灵试剂）,相关系数为0.961。正常参考值范围C3、C4分别为0.90～1.68g·L-1、0.110～0.408g·L-1。（4）稳定性:将免疫球蛋白类免疫比浊抗体试剂和标准品于37℃放置7天后,标准品散射光Value值有所下降,但标准曲线良好,检测范围无改变,3个阳性血清的测值与放置前接近,批内和批间精密度CV仍低于10%。我们的研究结果表明,建立的定时散射比浊分析法测定免疫球蛋白系统IgA、IgG、IgM以及C3、C4重复性好、准确度高、灵敏度高,与Dade Behring同类试剂测定结果有比较好的相关性,而且操作简单、反应时间短、检测样本量大以及可以实现自动化等优点,作为一种辅助诊断手段具有极大的临床应用潜力。本研究为进一步开发成熟的、临床用特种蛋白检测试剂奠定了坚实的基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 人血清免疫球蛋白A、G、M免疫比浊定量检测试剂的研制
• 材料和方法
• 1.材料
• 2.方法
• 2.1 标准品的制备
• 2.2 分析操作方法
• 2.3 测试的定标参数
• 2.4 室内质控
• 2.5 方法学评价
• 2.5.1 标准曲线
• 2.5.2 分析灵敏度
• 2.5.3 干扰试验
• 2.5.4 精密度试验
• 2.5.5 稳定性试验
• 2.5.6 正常参考值范围测定
• 2.5.7 与国外同类试剂的比较
• 2.6 统计学处理
• 结果
• 小结
• 第二部分 人血清补体C3、C4免疫比浊定量检测试剂的研制
• 材料和方法
• 1.材料
• 2.方法
• 2.1 标准品的制备
• 2.2 分析操作方法
• 2.3 室内质控
• 2.4 方法学评价
• 2.4.1 标准曲线
• 2.4.2 分析灵敏度
• 2.4.3 干扰试验
• 2.4.4 精密度试验
• 2.4.5 稳定性试验
• 2.4.6 正常参考值范围测定
• 2.4.7 与国外同类试剂的比较
• 2.5 统计学处理
• 结果
• 小结
• 第三部分 全自动特种蛋白免疫分析仪缓冲液的研制
• 材料和方法
• 1.材料
• 2.方法
• 2.1 缓冲液的配制
• 2.2 方法学评价
• 2.2.1 研制试剂理化指标的测定
• 2.2.2 标准曲线
• 2.2.3 对比试验
• 2.2.4 重复性试验
• 2.2.5 稳定性考察
• 2.3 统计学处理
• 结果
• 小结
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 缩略词
• 攻读硕士学位期间成果
• 致谢