脂肪源间充质干细胞在重型再生障碍性贫血中的实验研究

论文摘要

背景与目的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）存在于成人体内许多组织内,可以通过其贴壁能力分离出来。间充质干细胞有很强的克隆形成和扩增能力,并且具有向成骨,脂肪,软骨,神经和内皮等多向分化潜能。MSCs已经应用于很多疾病的临床治疗,包括急性心梗,自身免疫,辅助骨髓移植,神经系统损伤等。Friedenstein等于1976年最早利用骨髓贴壁细胞培养形成成纤维细胞和其它间质细胞,Toksoz等认为这种原始细胞可形成骨髓和外膜间质细胞,构成造血的微环境,形成结缔组织骨架并产生细胞因子、化学因子和细胞外基质蛋白来调节造血细胞的归巢和增殖。体内的稳态造血依赖于复杂而完整的骨髓造血微环境,主要通过骨髓内细胞和细胞间的相互作用、基质细胞产生的生长或抑制因子,以及细胞基质与造血细胞间的相互作用来调节造血功能。骨髓MSCs能合成IL-6、IL-11、SCF、flt-3配体等多种正性造血细胞生长因子,具有维持长期培养起始细胞（LTC-IC）增殖的能力,促进CD34+细胞的分化,提示MSC具有支持造血和促进造血恢复的作用。重型再生障碍性贫血（再障）是一种少见的因造血干细胞障碍导致外周血细胞和骨髓细胞减少的疾病。目前,造血干细胞移植已经成为能够根治重型再生障碍性贫血唯一有效的方法。但是,造血干细胞移植也面临诸多难题,而且某些问题如造血干细胞移植后造血重建缓慢,已经成为困扰从事干细胞临床移植的研究人员所面临的一尴尬问题。因此,以最经济有效的方法尽快解决这一难题,已经成为当务之急。有研究证明,来源于小鼠骨髓的多能干细胞经尾静脉输注入经致死剂量照射的异种系小鼠后,可有效促进其造血重建。在本研究中,我们通过体内外实验,初步探讨了脂肪源间充质干细胞（adipose tissue-derived mesenchymalstem cells,AMSCs）促进及重建造血的特性,以便为在临床运用患者或供者脂肪源多能干细胞联合造血干细胞移植治疗方案的实施提供理论基础。材料和方法1、实验动物及试剂BALB/c（H-2Kd）小鼠20只,雄性,6～8周龄,C57BL/6（H-2Kb）小鼠70只,雌性,7～8周龄,均购于河南省实验动物中心。实验小鼠在洁净环境中饲养:DMEM、MCDB-201、F12、谷氨酰胺、胰岛素、表皮生长因子;胎牛血清、马血清;胶原酶;胰酶;抗体:H-2Kd、FITC标记的荧光二抗。2、供体雄性BALB/c小鼠AMSCs的制备将20只6～8周龄的雄性BALB/c小鼠脱脊处死,取其腹部皮下脂肪组织,剪碎,用D-Hank’s液洗去血细胞,2g/LⅡ型胶原酶消化2h,洗掉胶原酶,离心收集细胞,细胞以2×106/ml的密度接种于含58%DMEM/F12+40%MCDB-201、2%胎牛血清（FCS）、10ng/mlEGF、1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸（Iusulin-Transferrin-Selenium,ITS）、1×亚油酸-牛血清白蛋白（linoleic acid-bovine serum albumin,LA-BSA）的培养液中,37℃、5%CO2培养箱培养,2d后换液,弃去未贴壁的细胞,以后每3天半量换液。当细胞达到70%～80%融合时,0.25%胰酶常规消化,细胞按照1:3传代。3、供体雄性BALB/c小鼠AMSCs的鉴定光镜下观察细胞形态,利用流式细胞术测定所培养细胞的免疫表型,用成骨、成脂肪诱导体系诱导细胞后,用Von Kossa染色检测钙化基质沉淀,用油红O染色检测细胞内脂肪滴的存在。4、供体小鼠骨髓细胞的制备将25只7～8周龄的雌性C57BL/6小鼠脱脊处死,无菌取其后肢的胫骨和股骨,以预冷的D-Hank’s液冲出骨髓细胞,经反复吹打分散细胞后,使之成单细胞悬液,以EDTA-NH4Cl液去除红细胞,再以D-Hank’s液洗涤2次。2g/L台盼兰染色按常规方法计算活细胞率。5、小鼠重型再生障碍性贫血（再障）模型采用60Co-γ+氯霉素（CH）+环磷酰胺（CY）的方法。具体方法:雌性C57BL/6（H-2Kb）小鼠45只一次全身3.0Gy60Co-γ（剂量率1.3531Gy/min,距离170cm,射时间2min 13s）照射后第4d、5d、6d时ipCY50.0mg.kg-1及CH 62.5 mg.kg-1。第8天实验小鼠即表现出典型再障的特点。6、体内移植将雌性C57BL/6（H-2Kb）再障小鼠随机分为3组,每组15只,照射后第10d从尾静脉输入细胞:①对照组,输入生理盐水,0.2ml/只;②输入雌性C57BL/6（H-2Kb）小鼠骨髓有核细胞（2×107/只）+雄性BALB/c小鼠AMSCs（3×106/只）;③输入雌性C57BL/6（H-2Kb）小鼠骨髓有核细胞（2×107/只）。精心喂养,观察各组小鼠的存活情况。小鼠在输注前查尾静脉血常规,计数有核细胞总数;输细胞后每周查血常规,指标同前。输注2周后各组分别取小鼠一侧股骨冲出骨髓,计数一条股骨有核细胞数,测定CFU-GM。7、流式细胞仪测定H-2Kd制备移植小鼠的脾脏和骨髓单个核细胞悬液,溶红细胞后进行抗体染色:取适量上述细胞,加入生物素化H-2Kd单抗孵育过夜,用含有0.01%叠氮钠和1%BSA的PBS洗两遍,加入适当稀释后的异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）—链霉亲和素,以PE-大鼠IgG同型对照为对照,4℃孵育45min,用上述洗液洗2次,流式细胞仪检测。8、Y染色体PCR试验实验及对照组小鼠Y染色体SRY基因的引物序列如下:P1:5’-CTGCTGTGAACAGACACTAC-3’:P2:5’-GACTCCTCTGACTTCACTTG-3’。PCR反应条件为:95℃预变性3min,然后94℃变性30s,61℃退火50s,72℃延伸40s,共进行28个循环,72℃再延伸8min。9、统计学处理应用SPSS软件,两样本均数间比较采用t检验,以P＜0.05为有统计学意义。结果1、BALB/c（H-2Kd）小鼠AMSCs的免疫表型:流式细胞仪检测AMSCs细胞CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105、Flk1及HLA-DR的表达,结果显示:CD29、CD44、CD105和Flk-1为阳性,CD31、CD34和HLA-DR为阴性。2、多项分化检测:成脂肪分化:AMSCs向脂肪细胞定向诱导14天后,未加脂肪诱导培养基的对照组细胞油红-O染色阴性,加入脂肪诱导培养基的试验组细胞可见油红-O染色强阳性。成骨分化:AMSCs向成骨细胞定向诱导14天后,未加成骨诱导培养基的对照组细胞Von Kossa染色未见黑色矿化物沉积,而试验组则见细胞间布满黑色颗粒,颗粒大小不均一,提示有矿化物质沉积。3、体内促进造血重建实验:从输注后第2周,联合输注AMSCs组小鼠外周血有核细胞、骨髓有核细胞数都明显高于单独输注小鼠骨髓有核细胞组小鼠（P＜0.05）,小鼠存活好;至输注后第3周,对照组小鼠大部分死于造血衰竭,治疗组也有少数小鼠死亡。但是治疗组无论外周血还是骨髓中的有核细胞都较第2周明显恢复;联合输注AMSCs组小鼠,其骨髓CFU-GM值于第2周明显高于单独输注小鼠骨髓有核细胞组小鼠（P＜0.05）;而单独输注生理盐水组小鼠,在第三周仅剩一只存活。联合输注AMSCs组小鼠通过PCR方法特异性地扩增SRY基因片段,以及用流式细胞仪检测移植小鼠骨髓及脾脏中CD3和H-2Kd双阳性细胞6.66%,结果表明,联合输注AMSCs组小鼠的骨髓细胞中有雄性供体小鼠源细胞的存在。结论成年小鼠AMSCs重建造血及促进机体造血恢复方面的特性是肯定的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 论文部分 脂肪源间充质干细胞在重型再生障碍性贫血中的实验研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 附图表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述部分 间充质干细胞在造血干细胞移植中的应用研究进展
• 参考文献
• 附录部分
• 英文缩略词
• 读硕期间发表文章
• 致谢