转galE和lgtC基因烟草糖组分变化的初步研究

论文摘要

来自大肠杆菌的galE基因,编码UDP-galactose-4-epimerase（EC 5.1.3.2）,该酶在正常的代谢途径中催化由UDP-葡萄糖向UDP-半乳糖的可逆转换。来自奈瑟氏脑膜炎球菌的lgtC基因,编码α-1,4-galactosyltransferase（EC 2.4.1.44）,该酶催化半乳糖残基从供体分子转移到受体分子上。本工作利用分别转galE基因和lgtC基因的烟草植株研究细胞糖组分的变化,探求galE基因和lgtC基因对转基因植株代谢和生长发育的影响。为了准确测定转基因烟草叶片的可溶性总糖组成和含量,本工作利用薄层层析方法分离和鉴定转基因植株的各种糖分,同时采用高效液相色谱分离和示差折光检测器测定技术定量叶片提取液中的蔗糖、葡萄糖和果糖含量,采用反向高效液相色谱分离和光电二极管阵列检测器测定UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖的含量。转galE基因烟草植株糖分测定以及galE酶活性分析本工作首先用RT-PCR方法筛选出galE基因高效表达的烟草转基因株系,然后对这些株系进行可溶性总糖、单糖和二糖以及核苷糖测定。在烟草酶提取液中加入底物UDP-葡萄糖后,反应液中出现产物UDP-半乳糖,即存在galE催化的反应。测定转基因植株的galE在不同条件下的酶活性,得出该酶在pH7-9之间具有活力,最适pH为7.5-8,最适酶反应温度约为20℃。转正义基因株系UDP-半乳糖的生成量是野生型对照和转反义基因株系的1.5-1.6倍。转基因烟草植株的糖分分析显示,转正义基因的株系E+41和E+54的可溶性总糖含量较对照株系显著提高,相应的葡萄糖、果糖和蔗糖含量与对照相比均有不同程度的提高;E+41和E+54的UDP-半乳糖含量与野生型相比显著提高,差异达到极显著（P≤0.01）;UDP-葡萄糖含量与野生型相比也显著提高。而转反义基因株系E-23的UDP-糖、可溶性总糖以及其它糖分含量均与野生型植株无明显差异。转基因植株生长发育观察和光合作用测定表明,向烟草中转入来源于原核生物的galE基因影响植株的生长发育和光合作用。对烟草种子萌发过程和植株生长发育各个时期的形态特征进行观察统计,结果发现,转正义基因植株在生长势方面明显优于野生型对照植株。与野生型对照植株相比,转正义基因植株幼苗具有更长的根系,在旺盛生长期具有更大的叶长、叶宽和叶面积,成熟期具有更高的植株高度,而且开花期相对较早。转正义基因植株的净光合速率明显高于野生型对照植株的。转反义基因植株在长势、开花期和净光合速率上均与野生型无明显差异。转lgtC基因烟草糖分的分析本工作采用RT-PCR技术选择出lgtC基因高效表达的转基因烟草株系,然后进行糖分测定,研究原核生物lgtC基因的引入对烟草植株体内糖组分及其含量的影响。糖分分析显示,转正义基因的株系C+27和C+43的可溶性总糖含量较野生型对照株系显著提高,其中葡萄糖、果糖和蔗糖含量与对照相比也有不同程度的提高;C+27和C+43的UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖含量较野生型均显著降低。而转反义基因株系C-32的可溶性总糖含量及葡萄糖、果糖、蔗糖的含量均与对照植株差别不大,但UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖含量与野生型相比均有降低。本论文分析了分别转galE和lgtC基因的烟草植株糖组分的变化,开展了原核生物糖代谢基因在植物基因工程中应用的尝试,探讨了糖代谢途径的遗传修饰对植株糖分积累和生长发育的影响。不仅为深入研究植物细胞糖代谢的调控机制鉴定出适宜的材料,而且为细胞糖代谢网络及其调控机制的揭示奠定了一定的工作基础,有重要的参考价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 1 前言
• 1.1 转基因植物作为生物反应器研究的进展
• 1.2 galE的研究进展
• 1.2.1 微生物和动物中的UDP-半乳糖-4-差向异构酶
• 1.2.2 高等植物中的UDP-半乳糖-4-差向异构酶
• 1.3 lgtC的研究进展
• 1.4 糖类物质分析方法研究进展
• 1.5 本工作的目的和意义
• 2 转galE基因烟草植株糖分测定以及galE酶活性分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 药品、试剂和溶液
• 2.1.4 种子萌发实验和植株生长发育状态观察记录
• 2.1.5 转基因植株的分子检测
• 2.1.6 转基因植株糖分含量测定
• 2.1.7 光合作用和叶绿素荧光参数的测定
• 2.1.8 galE酶活性分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 转基因植株的PCR检测和RT-PCR分析
• 2.2.2 种子萌发实验结果和植株生长发育状态统计
• 2.2.3 转基因植株糖分含量变化
• 2.2.3.1 可溶性总糖的含量
• 2.2.3.2 蔗糖、葡萄糖和果糖的含量
• 2.2.3.3 核苷糖（UDP-Gal和UDP-Glc）的含量
• 2.2.4 光合作用和叶绿素荧光参数测定结果
• 2.2.5 galE酶活性的分析
• 2.2.5.1 pH、温度以及反应时间对galE酶活性的影响
• 2.2.5.2 转基因植株galE酶活性的分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 转galE基因对烟草植株糖组分的影响
• 2.3.2 转基因烟草植株的galE酶活性
• 2.3.3 转galE基因对烟草植株生长发育的影响
• 3 转lgtC基因烟草糖分的分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株和质粒
• 3.1.3 药品、试剂和溶液
• 3.1.4 转基因植株的分子检测
• 3.1.5 转基因植株糖分含量测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 转基因植株的PCR检测和RT-PCR分析
• 3.2.2 转基因植株的形态观察
• 3.2.3 转基因植株糖分含量变化
• 3.2.3.1 可溶性总糖的含量
• 3.2.3.2 蔗糖、葡萄糖和果糖的含量
• 3.2.3.3 核苷糖（UDP-Gal和UDP-Glc）的含量
• 3.3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况表