论文摘要
本研究是利用定点诱变技术提高木聚糖酶的热稳定性。定点诱变是普遍用于分子生物学和生物化学的有效方法。随着PCR技术的发展,为定点诱变开辟了一条新途径。PCR介导的定点诱变与传统的定点诱变相比,无需制备M13单链噬菌体载体,缩短实验所需的时间,并且可以使突变体大量扩增,从而提高诱变效率。若所需突变位点位于DNA两端,可以直接用突变引物进行PCR,得到突变体;若所需突变位点不在DNA两端,则利用重叠延伸PCR法进行诱变。木聚糖酶能降解木聚糖成木糖或木寡糖,在饲料、造纸、食品以及能源工业中有着广泛的用途。木聚糖酶核心区域极其稳定,在靠近可变的α螺旋C一端构建二硫键,可能会提高木聚糖酶分子的热稳定性。通过在蛋白质的N末端附近一个残基的置换和嵌合改变,引入二硫桥,使木聚糖酶的稳定性得到很大的提高,同时也可通过突变获得扩展在碱性pH下的活性范围。本实验室克隆的得到的木聚糖酶基因DQ147775与已经报道的木聚糖酶基因AY536638仅有3个核苷酸不同,二者同源性高达99%以上。而DQ147775与AY536638相比在3端少5个碱基而不完整。在对木聚糖酶基因DQ147775进行蛋白质Blast、DNABlast和大量参考文献的分析基础上。通过Primer Premier5.0和Oligo6.0设计了6条突变引物。在引物A0中加入5个碱基,补齐632—636 5个碱基,增加了一个丝氨酸和一个终止密码子。第二对引物:S1在原蛋白质序列的第3位和第5位增加半胱氨酸（3C/5C）。A1在原蛋白质序列的第212位增加一个半胱氨酸（212C）。第三对引物:在原蛋白质序列的第39位甘氨酸替换为半胱氨酸（G39C）。上游引物和下游引物有20个碱基是重叠的。通过重叠延伸PCR的得到的片断1有141个碱基,片断2有525个碱基。通过组合,用OE-PCR和PCR扩增获得8个突变基因。突变基因经过酶切、酶连、转化。经电泳鉴定,突变基因确实克隆到质粒pYES6上。将含有突变基因的重组质粒转化入酿酒酵母中。在酿酒酵母中进行诱导表达。以空质粒为对照,以完整酶为标准,在以不损失酶活为前提下筛选热稳定性最好的突变体。筛选到突变体8号。酿酒酵母INVScl中高效表达的重组酶最适温度为55℃,最适pH为4.0,在55℃的半灭活时间为15min。在60℃的半灭活时间为5min,最适温度提高了5℃。最适pH改变不大,热稳定性有提高。