论文摘要
背景：黑色素瘤抗原（Melanoma antigen-encoding，MAGE）是第一个从黑色素瘤中发现的一组肿瘤相关性抗原（tumor-associated antigen，TAA）。人类MAGE基因家族编码的肿瘤排斥抗原（tumor rejection antigen，TRA）在细胞内经加工产生抗原肽，并与HLA-I类分子结合形成复合物，能诱导自体细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL）特异性识别，诱导其对相应肿瘤细胞的特异性杀伤。MAGE基因在许多恶性肿瘤中都有较高的表达，而在正常组织（除胎盘滋养层及睾丸精原细胞之外）、炎症组织及良性肿瘤组织中均无表达，因而被认为是肿瘤特异性的，可用于肿瘤的分子学诊断和免疫治疗。初步的临床实验已证实了该MAGE基因在抗肿瘤治疗中的意义。拓扑替康（Topotecan，TPT）是细胞核拓扑异构酶I的独特而有效的抑制剂，它通过与DNA／拓扑异构酶I聚合物形成稳定的共价复合物来发挥其抗肿瘤作用。近来发现它对多种难治性实体肿瘤尤其对部分血液系统肿瘤有效，单用topotecan治疗复发、难治非霍杰金淋巴瘤有效率达40％。虽然TPT在治疗白血病、淋巴瘤等恶性血液病的临床实验中已显示了明显的抗肿瘤活性，但对其作用的分子机理尚不清楚。TPT对淋巴瘤细胞的作用及其与MAGE基因之间的关系有待探讨。本实验旨在研究TPT诱导T细胞淋巴瘤系HPB-AM细胞株凋亡的作用及TPT作用与MAGE基因之间的关系，为进一步了解TPT对肿瘤细胞的作用机制，提高TPT的临床疗效提供有意义的实验资料。方法：1．本研究以T细胞淋巴瘤系HPB-AM细胞株为研究对象，采用半定量逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）方法在mRNA水平检测MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4基因的表达情况。2．采用四甲基偶氮唑盐光吸收法（MTT法）检测不同浓度（0μmol／L，0.05μmol／L，0.1μmol／L，0.15μmol／L，0.20μmol／L）TPT作用于HPB-AM细胞株不同时间后（0、4、8、12、16小时）的增殖情况，计算各组细胞的增殖抑制率，并确定TPT抑制HPB-AM细胞增殖的最小有效浓度和最短作用时间。倒置显微镜下观察细胞生长状态及形态学改变。3．采用半定量RT-PCR方法在mRNA水平检测TPT对HPB-AM细胞株MAGE基因表达的影响。4．应用SPSS10.0统计软件进行统计学处理，统计学数据用均数±标准差（（?）±s）表示。两样本均数的比较采用独立样本的T检验，多样本均数的比较采用单因素方差分析。重复5次独立试验，检验水准以p值＜0.05为差异有显著性。结果：1．HPB-AM细胞MAGE基因的表达MAGE-3的表达水平为0.94±0.03，MAGE-4的表达水平为0.85±0.01，MAGE-1、MAGE-2均无表达。2．TPT对HPB-AM细胞株增殖的抑制作用①采用MTT比色法检测结果：不同浓度（0μmol／L，0.05μmol／L，0.10μmol／L，0.15μmol／L，0.20μmol／L）TPT作用HPB-AM细胞不同时间（4、8、12、16小时），其对HPB-AM细胞的抑制作用随浓度的增高而逐渐增强，随时间的延长而逐渐增强。最小有效浓度为0.10μmol／L，浓度为0.15μmol／L时抑制作用明显，达到0.20μmol／L时抑制作用不再增加；最短作用时间为8小时，12小时抑制作用明显增强，超过16小时抑制作用不再增加。空白对照组抑制率无变化。②TPT作用细胞后的形态学改变：浓度0.10μmol／L的TPT作用HPB-AM细胞12h后，倒置显微镜下观察发现细胞集落减少，细胞中颗粒增多，细胞碎片增多，而TPT作用前细胞均呈悬浮生长，细胞轮廓清楚，生长旺盛。3．TPT对HPB-AM细胞MAGE基因表达的影响RT-PCR结果显示：当TPT浓度为（0μmol／L，0.05μmol／L，0.10μmol／L，0.15μmol／L，0.20μmol／L），作用12小时时，MAGE-3基因相对表达量随TPT浓度增加而减少，分别为0.94±0.03、0.87±0.05、0.78±0.03、0.65±0.05、0.59±0.06。在浓度为0.10μmol／L时基因表达明显受抑（p=0.0299）。TPT浓度为0.10μmol／L，作用0、4、8、12、16小时时MAGE-3表达分别为0.94±0.03、0.86±0.04、0.77±0.03、0.65±0.05、0.59±0.03，在作用时间为8小时时基因表达明显受抑（p=0.0140）。当TPT浓度为（0μmol／L，0.05μmol／L，0.10μmol／L，0.15μmol／L，0.20μmol／L），作用12小时时，MAGE-4基因相对表达量随TPT浓度增加而减少，分别为0.86±0.01、0.77±0.04、0.61±0.05、0.50+0.02、0.45±0.03。在浓度为0.1μmol／L时基因表达明显受抑（p=0.0011）。TPT浓度为0.10μmol／L，作用0、4、8、12、16小时时MAGE-4表达分别为0.85±0.04、0.78±0.02、0.67±0.05、0.45±0.02、0.41±0.04，在作用时间为8小时时基因表达明显受抑（p=0.0403）。结论：1．HPB-AM细胞表达MAGE-3、MAGE-4基因；不表达MAGE-1、MAGE-2基因。2．拓扑替康能抑制HPB-AM细胞株的增殖，其抑制作用具有时间和浓度依赖性，本实验条件下最小抑制浓度为0.10μmol／L，最短抑制时间为8小时。3．拓扑替康能抑制HPB-AM细胞中MAGE-3和MAGE-4 mRNA的表达，且具有时间和浓度依赖性。